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Dissertation

Autor(en): Andrea Hauser
Titel: HIV-1 Resistenzentwicklung nach Einsatz antiretroviraler Medikamentenregime zur Prävention der Mutter-Kind-Übertragung von HIV in Uganda und Tansania
Gutachter: Gundel Harms-Zwingenberger; Rupert Mutzel
Hochschule: Freie Universität Berlin
Erscheinungsdatum: 17.09.2012
Volltext: pdf (urn:nbn:de:0257-10032332)
Fachgebiet(e): Medizin
Schlagwörter (ger): HIV, Tansania, HIV-1, Mutter-Kind-Übertragung, Uganda
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Abstract (ger):
Subsahara-Afrika ist die weltweit am stärksten betroffene Region von HIV/AIDS. Im Jahr 2010 entfielen ca. 68% aller HIV-Infektionen und 90% der HIV-Neuinfektionen bei Kindern (<15 Jahre) auf diese Region. Nahezu alle Infektionen von Kindern sind die Folge einer HIV-Übertragung von der Mutter auf das Kind (vertikale Transmission). Zur Prävention der Mutter-Kind-Übertragung von HIV werden in Subsahara-Afrika seit 2001 antiretrovirale Regime eingesetzt, die auf Empfehlungen der WHO basieren. Eine Nevirapin (NVP) - Einmaldosis für die HIV-positive Schwangere und das Neugeborene zur Geburt stellten für viele Jahre die antiretrovirale Standardprophylaxe in den meisten Ländern Subsahara-Afrikas dar. Zur effektiveren Reduktion der HIV-Transmission aktualisierte die WHO 2006 ihre Empfehlungen zugunsten eines antiretroviralen Dreifachregimes. Dieses bestand für die Mutter aus Zidovudin (AZT) ab der 28. Schwangerschaftswoche, einer NVP-Einmaldosis zur Entbindung sowie AZT und Lamivudin (3TC) für sieben weitere Tage und sah für das Neugeborene eine NVPEinmaldosis zur Geburt mit siebentägiger postnataler AZT-Ergänzung vor. Die zeitlich begrenzte Einnahme solcher Regime birgt jedoch die Gefahr der Resistenzentstehung insbesondere dann, wenn lange Halbwertszeiten der Medikamente zu suboptimalen Wirkstoffspiegeln im Blut führen. Sowohl dies als auch der Einsatz nur eines Medikaments führen zu einem Selektionsdruck auf die replizierende Viruspopulation und resultieren, in Verbindung mit einer geringen genetischen Resistenzbarriere, in einer sehr raschen Entstehung resistenter Virusvarianten.
Resistenzen können wiederum zukünftige Behandlungsoptionen für die HIV-positiven Mütter und deren vertikal infizierte Kinder einschränken. Die Kenntnis um das Ausmaß der Resistenzentstehung nach antiretroviralen Prophylaxeregimes ist daher in Ländern ohne Zugang zur genotypischen Resistenzbestimmung von großer Bedeutung für den Erfolg einer später notwendigen antiretroviralen Langzeittherapie.

Da die Resistenzen oft nur in geringen Anteilen in der viralen Quasispezies des HIVInfizierten vorkommen (minoritäre Varianten), werden sie mit der routinemäßig durchgeführten genotypischen Resistenzbestimmung (Sanger-Sequenzierung der Populationssequenz; Detektionslimit ca. 20%) methodenbedingt nicht erfasst. Daten zur Entstehung von minoritären Resistenzen in Anteilen <20% nach NVP-Einmaldosis liegen nur begrenzt vor und fehlen für das antiretrovirale Prophylaxeregime mit AZT, 3TC und NVP nach 2006 WHO-Empfehlungen. In den vorliegenden Einzelarbeiten wurden daher resistente Viruspopulationen inklusive minoritärer Varianten in Plasma- und/oder Brustmilchproben von 39 HIV-positiven Müttern und deren vertikal infizierte Kinder nach einer NVP-Einmaldosis (Studienkollektiv: West-Uganda 2003-2005) bzw. in Plasmaund/ oder Buffycoat-Proben von 50 Mutter-Kind-Paaren nach Dreifachregime (Studienkollektiv: Südwest-Tansania 2008-2009) untersucht. Hierzu wurden hochsensitive Allel-spezifische PCR (ASPCR) Assays für die in Uganda und Tansania prävalenten HIVSubtypen A und D bzw. A, C und D und die regimebedingt am häufigsten zu erwartenden Resistenzmutationen in der Reversen Transkriptase (RT) etabliert. Zusätzlich wurden 13 ASPCR-voranalysierte Proben mit einer amplikonbasierten ultra-sensitiven Sequenzierungsmethode (UDS) auf das Vorliegen weiterer minoritärer Resistenzmutationen in der viralen RT getestet. Ziele der Promotionsarbeit waren die Eignung der beiden Methoden zum sensitiven Resistenznachweis und auch die beiden antiretroviralen Medikamentenregime unter dem Aspekt der Resistenzentwicklung zu bewerten.
Beide Methoden, ASPCR und UDS, ermöglichten den Nachweis von resistenten HIVVarianten in Anteilen kleiner als 1%. In der Amplikon-Generierung als der wesentliche initiale Schritt beider Methoden war die ASPCR 30mal sensitiver als die UDS (650 versus 20.000 Kopien/ml). Die ASPCR war daher die bevorzugte Methode zur sensitiven Resistenztestung von Proben der Studienkollektive mit niedrigen Viruslasten.
Ein Vergleich der ASPCR-Ergebnisse zeigte, dass sowohl die NVP-Einmaldosis als auch das Dreifachregime mit AZT, 3TC und NVP häufig zur Entstehung resistenter Virusvarianten führten (62% bzw. 40%). Bei jeweils der Hälfte der Frauen lagen diese als minoritäre Virusvarianten in Anteilen <5% im Plasma vor. Während nach Einnahme des Dreifachregimes die Entstehungshäufigkeit von NVP-Resistenzen geringer war als nach einer NVP-Einmaldosis allein (62% versus 18%), entstand jedoch bereits bei einer durchschnittlichen pränatalen AZT-Einnahme über 7,5 Wochen ein erheblicher Anteil an AZT-resistenten Virusvarianten (22%). Die HIV-Übertragungsraten waren in beiden Studienkollektiven vergleichbar und mit 9,3% (NVP-Einmaldosis) und 14,3% (Dreifachregime) sehr hoch. Bei jeweils knapp der Hälfte der vertikal infizierten Kinder wurden ebenfalls resistente HIV-Varianten identifiziert; eine vertikale Transmission resistenter HIV konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Das Vorliegen von resistenten Viren im mütterlichen Plasma noch 18 Monate nach der NVP-Einmaldosis und in proviraler DNA mütterlicher Blutzellen nach Einnahme des Dreifachregimes weist auf die Persistenz von Resistenzmutationen über mehrere Monate hin. Diese könnten den Erfolg von Therapien, die innerhalb des ersten Jahres nach Transmissionsprophylaxe begonnen werden, einschränken. Während die Entstehung monoresistenter Viren nach NPVEinmaldosis die Medikamentenoptionen für NNRTI-haltige Therapien limitiert, könnten AZT/NVP-selektierte Resistenzmutationen nach einem Dreifachregime anschließende Therapieoptionen durch den Ausschluss von mehreren Medikamenten der NNRTI- und NRTI-Klasse drastisch einschränken. Zur effektiveren Reduktion der vertikalen Transmission und der Resistenzentstehung sollten daher schwangere HIV-positive Frauen antiretrovirale Medikamente nur als Kombinationstherapie (cART) mindestens für die Dauer der Schwangerschaft und Stillzeit erhalten.
Abstract (eng):
Sub-Saharan Africa represents the most heavily HIV-affected region worldwide. In 2010 this region accounted for approximately 68% of all HIV-infections and 90% of new HIV infections in children (<15 years). Almost all HIV infections in children are the result of mother-to-child transmission (vertical transmission). Antiretroviral regimens based on WHO recommendations have been implemented in Sub-Saharan Africa since 2001 to prevent the mother-to-child transmission of HIV. A single-dose (SD) of nevirapine (NVP) for the HIV-positive pregnant women and their newborn children at birth has been the standard regimen in most Sub-Sahara African countries for many years. In order to more effectively reduce HIV transmission, the WHO recommendations were updated in 2006 in favor of a triple antiretroviral regimen. This regimen consists, for the mother, of zidovudine (AZT) starting at the 28th week of pregnancy, NVP-SD during labor and AZT plus lamivudine (3TC) at birth and for seven days thereafter. The child receives NVP-SD at birth and AZT for seven days. However, the temporary nature of such regimes poses the risk of resistance development, particularly if the long half-lives of drugs results in suboptimal levels in the blood. Both this and the use of only a single drug lead to a selective pressure on the replicating virus population and, in combination with a low genetic barrier to development of drug resistance, result in the rapid emergence of resistant viral variants. Resistance may negatively impact future treatment options for HIV-positive mothers and their vertically infected children. Knowledge of the scope of resistance development after antiretroviral prophylaxis in countries without access to genotypic resistance testing is therefore of great importance for the success of a subsequent long-term therapy.

Resistance mutations are frequently present in the viral quasispecies of HIV-infected patients at only low proportions (minor variants) and are not detectible by routine genotypic resistance testing (Sanger sequencing of population sequence, detection limit approximately 20%). Data is limited regarding the emergence of resistance in proportions under 20% after NVP-SD and is lacking for the antiretroviral regimen using AZT, 3TC and NVP recommended by the WHO in 2006. To address this, the sub-studies presented here investigated in detail the emergence of resistant virus variants, including minor variants, in the plasma and/or breast milk of 39 HIV-positive mothers and their vertically infected children after exposure to the NVP-SD (study cohort: Western Uganda 2003-2005) or in the plasma and/or buffy coats of 50 mother-child pairs after triple antiretroviral prophylaxis (study cohort: Southwest Tanzania, 2008-2009). A highly sensitive allelespecific PCR (ASPCR) specific for the most prevalent subtypes A and D in Uganda or A, C and D in Tanzania and for the most common regimen-selected resistance mutations in the reverse transcriptase (RT) was established for the analysis. In addition, 13 samples preanalysed by ASPCR were tested in parallel with an amplicon-based ultra-deep sequencing method (UDS) for the presence of further minor resistance mutations within the viral RT. The aim of this dissertation was to assess the suitability of the two sensitive detection methods and of the antiretroviral prophylaxis regimen in terms of resistance development. Both methods, ASPCR and UDS, enabled the detection of resistant HIV-variants at proportions under 1%. ASPCR was found to be 30 times more sensitive than the UDS (650 versus 20,000 copies/ml) in amplicon generation, an essential initial step for both methods and was therefore the preferred method for the sensitive resistance testing of study samples with low viral loads.
A comparison of ASPCR results demonstrated that the NVP-SD as well as the triple regimen with AZT, 3TC and NVP frequently selected for resistant viral variants (62% versus 40% respectively). Resistant plasma virus variants were present as minorities at proportions under 5% in half of the women from both study cohorts. While the development of NVP-resistance was reduced after triple prophylaxis compared to the NVP-SD alone (from 62% to 18%), a high proportion of additional AZT-resistance mutations emerged after a median 7.5 weeks of prepartal AZT treatment (22%). The transmission rates were comparable and very high in both study cohorts (9.3% for NVPSD and 14.3% for the triple regimen). Both regimens selected for resistant virus in almost half of the vertically infected children, although vertical transmission of resistant virus could not be demonstrated. The presence of resistance mutations in maternal plasma-virus for 18 months after NVP-SD and in the proviral DNA of the maternal host cells after treatment with the triple regimen demonstrates the persistence of resistant mutations that might impact the success of a “first line” therapy if initiated within the first year after antiretroviral transmission prophylaxis. While the presence of mono-resistant viruses after NVP-SD may limit the options of first-line therapies using NNRTIs, the AZT/NVPresistance mutation selected by the triple regimen could drastically reduce subsequent treatment options by excluding several NNRTIs and NRTIs. Therefore, to reduce vertical transmission and the development of resistance, a combination of antiretroviral drugs (cART) should be offered to all pregnant HIV-infected women at least for the duration of pregnancy and breast-feeding.
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Generiert am 25.04.2017, 20:03:46