edoc-Server des Robert Koch-Instituts

Diplomarbeit

Autor(en): Stephan Binder
Titel: Expression rekombinanter, von HIV-1 gp41 abgeleiteter Proteine für die Analyse der Immunpathogenese
Gutachter: Reinhard Kurth; Fritz Kreuzaler
Betreuer: Joachim Denner; Magdalena Eschricht
Hochschule: Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen
Erscheinungsdatum: 01.06.2009
Volltext: pdf (urn:nbn:de:0257-10035155)
Fachgebiet(e): Medizin
Schlagwörter (ger): HIV-1, gp41, Immunpathogenese
Metadatenexport: Um den gesamten Metadatensatz im Endnote- oder Bibtex-Format zu speichern, klicken Sie bitte auf den entsprechenden Link. Endnote   Bibtex  

Abstract (ger):
Zur Etablierung eines Endotoxin-freien Bacillus megaterium Produktionssystems wurden zehn mittels PCR amplifizierte, von HIV-1 g41 abgeleitete Fragmente hergestellt und in transformations-kompetente B. megaterium Protoplasten eingebracht. Durch Optimierung bestehender Standardprotokolle zur Herstellung von Protoplasten war es möglich Transformationseffizienzen von etwa 102 cfu pro μg DNA zu erreichen und somit von der kostenintensiven Verwendung kommerziell erhältlicher B. megaterium Protoplasten abzusehen.
Von insgesamt über 500 getesteten Klonen konnten ca. 200 mittels colony-PCR für positiv befunden werden. Allerdings wurden lediglich drei Klone identifiziert, die auch in der Lage zur heterologen Expression der Fremdproteine waren. Erreichte Expressionslevel waren extrem niedrig und konnten selbst nach aufwendigen Anstrengungen zur Optimierung und Bestimmung optimaler Expressionsbedingungen nicht signifikant gesteigert werden. Nach Aufreinigung von StrepII-ΔNHR 4K-His aus der intrazellulären Proteinfraktion (Zellpellet) konnten letztendlich Proteinmengen von rechnerisch ca. 80 μg ermittelt werden, wobei es nicht möglich war, StrepII-ΔNHR 4K-His in reiner Form zu gewinnen. Entgegen allen Erwartungen führte die Codon-Optimierung von ΔNHR 4K entsprechend der codon usage bias von B. megaterium MS941 zu einer verminderten Proteinproduktion, was auf mögliche Sekundärstrukturen der resultierenden messenger-RNA zurück zu führen ist.
Aufgrund der im Vergleich zu E. coli ausgesprochen niedrigen Transformationseffizienz, sowie dem äußerst schlechten Vermögen zur Produktion der HIV-1 gp41 Verkürzungsmutanten, konnte B. megaterium für diese Zwecke nicht als geeigneter Produktionsorganismus genutzt werden. Im Gegensatz hierzu war es möglich, das transmembrane Hüllprotein gp36 des humanen endogenen Retrovirus K (HERV-K) in der methylotrophen Hefe Hansenula polymorpha RB11 überzuexprimieren und eine Gesamtmenge von etwa 540 μg aus 1 L Expressionskultur aufzureinigen. Zum Aufschluss der äußerst robusten Hefezellwände erwies sich der Einsatz von Zymolyase in Kombination mit dem mechanischen Aufschluss durch Glaskugeln als äußerst effektiv.
Untersuchungen bezüglich der immunsuppressiven Eigenschaften von HERV-K TM auf humane PBMCs zeigten eine konzentrationsabhängige Steigerung der IL-10 Sekretion nach 24-stündiger Inkubation, welches als Marker für eine immunsuppressive Wirkung angesehen werden kann. Da dieses Ergebnis bereits in Vorarbeiten der Arbeitsgruppe gezeigt werden konnte, kann H. polymorpha somit als geeigneter Wirt für die Endotoxin-freie Produktion von HERV-K TM bestätigt werden und bietet sich ebenfalls für die Produktion der gp41 Verkürzungsmutanten an.
Nutzungsbedingungen
Für Dokumente, die in elektronischer Form auf diesem Dokumentenserver bereitgestellt werden, gilt uneingeschränkt das Urheberrechtsgesetz (UrhG). Vor allem gilt, dass die Dokumente zu wissenschaftlichen Zwecken und zum Eigengebrauch zitiert, kopiert, abgespeichert, ausgedruckt und weitergegeben werden dürfen (§53 UhrG), es sei denn, dem einzelnen Dokument sind abweichende und dann allein maßgebliche Nutzungsbedingungen vorangestellt. Jede kommerzielle Nutzung der Dokumente, auch von Teilen und Auszügen, ist ohne vorherige Zustimmung des Urhebers/Autors untersagt.
Terms of use
Documents which are provided on this repository are subject to strict copyright conditions. This applies in particular to the following: the documents made available on this publication server may be cited, copied, saved, printed and passed on for scientific purposes and private use (§53 German Copyright Law), unless the individual document is preceded by deviating and then exclusively applicable terms and conditions of use. Any commercial use of the documents, even in part and excerpts, is prohibited without the prior written consent of the creator.
Zugriffsstatistik: Die Daten für die Zugriffsstatistik der einzelnen Dokumente wurden aus den durch AWSTATS aggregierten Webserver-Logs erstellt. Sie beziehen sich auf den monatlichen Zugriff auf den Volltext sowie auf die Startseite.
 
Bei Formatversionen eines Dokuments, die aus mehreren Dateien bestehen (insbesondere HTML), wird jeweils der monatlich höchste Zugriffswert auf eine der Dateien (Kapitel) des Dokuments angezeigt.
 
Um die detaillierten Zugriffszahlen zu sehen, fahren Sie bitte mit dem Mauszeiger über die einzelnen Balken des Diagramms.
Startseite: 32 ZugriffePDF: 45 ZugriffeStartseite: 33 ZugriffePDF: 21 ZugriffeStartseite: 17 ZugriffePDF: 33 ZugriffeStartseite: 11 ZugriffePDF: 32 ZugriffeStartseite: 18 ZugriffePDF: 46 ZugriffeStartseite: 12 ZugriffePDF: 29 ZugriffeStartseite: 10 ZugriffePDF: 38 ZugriffeStartseite: 10 ZugriffePDF: 33 ZugriffeStartseite: 12 ZugriffePDF: 53 ZugriffeStartseite: 10 ZugriffePDF: 48 ZugriffeStartseite: 15 ZugriffePDF: 70 ZugriffeStartseite: 17 ZugriffePDF: 65 ZugriffeStartseite: 16 ZugriffePDF: 58 ZugriffeStartseite: 14 ZugriffePDF: 55 ZugriffeStartseite: 12 ZugriffePDF: 63 ZugriffeStartseite: 13 ZugriffePDF: 51 ZugriffeStartseite: 17 ZugriffePDF: 61 ZugriffeStartseite: 15 ZugriffePDF: 52 ZugriffeStartseite: 9 ZugriffePDF: 33 ZugriffeStartseite: 17 ZugriffePDF: 24 ZugriffeStartseite: 51 ZugriffePDF: 31 ZugriffeStartseite: 75 ZugriffePDF: 29 ZugriffeStartseite: 7 ZugriffePDF: 93 ZugriffeStartseite: 8 ZugriffePDF: 25 Zugriffe
Mar
15
Apr
15
May
15
Jun
15
Jul
15
Aug
15
Sep
15
Oct
15
Nov
15
Dec
15
Jan
16
Feb
16
Mar
16
Apr
16
May
16
Jun
16
Jul
16
Aug
16
Sep
16
Oct
16
Nov
16
Dec
16
Jan
17
Feb
17

Gesamtzahl der Zugriffe seit Mar/2015:

  • Startseite – 451 (18.79 pro Monat)
  • PDF – 1088 (45.33 pro Monat)
  •  
Generiert am 23.03.2017, 09:22:00