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Diplomarbeit

Autor(en): Jörg Votteler
Titel: Hemmung der Expression von HIV und porcinen endogenen Retroviren mittels RNA-Interferenz
Betreuer: Joachim Denner
Hochschule: Technische Universität Berlin
Erscheinungsdatum: 01.08.2004
Volltext: pdf (urn:nbn:de:0257-10035364)
Fachgebiet(e): Medizin
Schlagwörter (ger): HIV, RNA-Interferenz, Hemmung, Expression
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Abstract (ger):
Im Genom von Schweinen befinden sich provirale Sequenzen von porcinen endogenen Retroviren (PERVs), welche replikationskompetente Viren codieren. Die Sequenz eines A/C-rekombinanten PERV, bestehend aus dem gag/pol-Bereich von PERVC und dem env-Gen von PERV-A, wurde kloniert. Damit konnte zum ersten Mal das gesamte Genom dieses rekombinanten Subtyps sequenziert und analysiert werden. Zudem handelte es sich um ein auf humanen Zellen adaptiertes Virus, welches durch den Einbau zusätzlicher repetitiver Elemente in die LTR einen höheren Virustiter erreicht. In Zellen, die mit den Molekularklonen transfiziert wurden, konnten die VolllängenmRNA sowie die gespleißte env-mRNA nachgewiesen werden. Ebenfalls wurde das virale Gag-Protein und die reverse Transkriptase detektiert. Die Produktion infektiöser Partikel konnte bislang nicht nachgewiesen werden, die Ursachen werden analysiert.
Um die Expression von PERV und HIV mittels RNA-Interferenz zu hemmen, wurden shRNA-Expressionskassetten gegen Target-Sequenzen innerhalb der viralen mRNAs in Vektoren kloniert. Es konnte gezeigt werden, das mittels RNA-Interferenz die Expression von HIV-1 unterdrückt wird. Expressionskassetten mit shRNAs gegen die HIV-1-Gene gag und rev wurden in konventionelle Expressionsvektoren kloniert. In HIV-1-infizierten HeLa-P4- und C8166-Zellen konnte mit diesen Konstrukten eine deutlich Reduktion der viralen Replikation erreicht werden. Auch mit den lentiviralen Konstrukten gegen HIV-1-rev und -tat war eine deutliche Hemmung der HIV-1-Expression messbar. Durch den Einbau von Fehlpaarungen in das 3´-Ende des Sense- Stranges konnte die Effizienz der shRNAs nicht gesteigert werden.
Zur Hemmung der PERV-Expression wurden ebenfalls lentivirale Vektoren generiert, welche eine shRNA-Expressionskassette gegen eine im pol-Gen von PERV befindliche Sequenz trugen. Mit diesen Konstrukten wurden porcine Fibroblasten transduziert. Zum ersten Mal konnte eine Hemmung der Expression von PERV in primären Schweinezellen gezeigt werden.
Mit diesen lentiviralen Konstrukten wäre es möglich, transgene Schweine zu erstellen, in deren Zellen die virale Expression herunterreguliert ist, wodurch diese Schweine eine erhöhte Sicherheit vor einer Infektion mit PERV bei einer Xenotransplantation bieten könnten.
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Generiert am 19.10.2017, 07:16:22