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Bachelorarbeit

Autor(en): Anna Friederike Thrun
Titel: Charakterisierung der Funktion des SH-Proteins bei der Apoptose-Induktion in Mumpsvirus-infizierten Zellen
Gutachter: Annette Mankertz; Markus Wahl
Hochschule: Freie Universität Berlin
Erscheinungsdatum: 01.08.2013
Volltext: pdf (urn:nbn:de:0257-10037487)
Fachgebiet(e): Medizin
Schlagwörter (ger): Rekombinantes Mumpsvirus, SH-Protein, Apoptose, PARP, RT2-Profiler
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Abstract (ger):
Eine Infektion mit der weltweit verbreiteten Kinderkrankheit Mumps kann bei Jugendlichen und Erwachsenen zu schwerwiegenden Komplikationen wie Orchitiden, Meningitiden und Enzephalitiden führen. Der Erreger, das ubiquitär vorkommende Mumpsvirus (MuV), gehört zur Familie der Paramyxoviridae und kodiert unter anderem für ein kleines, hydrophobes Protein (SH-Protein, small hydrophobic protein), dessen Funktion bislang nicht genau geklärt ist. Die Expression des Proteins scheint zwar für das Wachstum des Virus in vitro nicht essentiell zu sein, allerdings interagiert das SH-Protein mit dem TNF-α-Rezeptor und hemmt die TNF-α-induzierte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB, wodurch eine entscheidende Bedeutung für die Replikation in vivo nicht ausgeschlossen ist.
Aufgrund der bisherigen Forschungsergebnisse wird eine anti-apoptotische Eigenschaft des SH-Proteins in Mumpsvirus-infizierten Zellen vermutet, welche in dieser Arbeit weiter untersucht werden sollte. In der Arbeitsgruppe Mankertz wurden bereits die rekombinanten Mumpsviren rMuV-SH-C-flag und rMuV-SH-3stop-C-flag erzeugt, wobei durch Einfügen mehrerer Stopp-Kodons in das SH-Gen bei zuletzt genanntem kein SH-Protein mehr exprimiert wird. Vero und A549 Zellen wurden mit den Viren rMuV-SH-C-flag bzw. rMuV-SH-3stop-C-flag infiziert und mittels Western- Blot-Analysen wurde eine Apoptose-Kinetik anhand der für Apoptose charakteristischen PARP-Spaltung erstellt. Um den Einfluss des Mumpsvirus auf die zellulären Signalwege bei der Apoptose-Induktion infizierter Zellen ermitteln zu können, wurde zusätzlich ein RT2 Profiling PCR Array durchgeführt, welches die Genexpression während der Apoptose-Induktion quantifiziert.
Western Blot Analysen zeigten in Vero und A549 Zellen eine verzögerte Spaltung des Apoptose-Markers PARP bei rMuV-SH-C-flag-Infektion im Vergleich zu rMuV-SH- 3stop-C-flag-infizierten Zellen. Die Apoptose-Induktion Mumps-infizierter Zellen wird folglich durch das SH-Protein inhibiert, was die bereits beschriebene anti-apoptotische Funktion des SH-Proteins weiter unterstützt. Des Weiteren lieferte die Untersuchung der Genexpression rMuV-SH-C-flag-infizierter A549 Zellen eine Hochregulation der Kaspasen-1, -7 und -4, sowie TNF-verwandter Faktoren (TNFSF10, TNFRSF1B, TNF) und BIRC3. Die Hochregulation proapoptotischer Gene in Mumpsvirus-infizierten Zellen belegt somit die Apoptose-induzierenden Eigenschaften des rekombinanten Mumpsvirus und lässt vermuten, dass diese TNF- oder Kaspase-1-vermittelt induziert wird.
Um das Verständnis des Mumpsvirus zu erweitern und neue therapeutische Ansätze entwickeln zu können, ist die Untersuchung der genauen Mechanismen während einer Infektion essentiell. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen dazu bei und stellen eine Grundlage für weitere Untersuchungen zur Analyse der Funktion des SH-Proteins bei der Apoptose-Induktion in infizierten Zellen dar.
Abstract (eng):
An infection of the widespread childhood disease mumps can cause serious complications such as orchitis, meningitis, or encephalitis among adolescents and adults. Mumps virus (MuV), the ubiquitious agent of mumps, belongs to the family of Paramyxoviridae and encodes among other proteins a small, hydrophobic protein (SH protein) the function of which is not fully understood. Expression of the SH protein does not appear to be required for virus growth in vitro; however, it interacts with the TNF-α receptor and inhibits the TNF-α induced activation of the transcription factor NFκB. Therefore, the SH protein might have a crucial relevance for the replication in vivo.
Due to previous research results an anti-apoptotic characteristic of SH protein in mumps virus infected cells is assumed. In the laboratory of PD Dr. Annette Mankertz two recombinant mumps viruses, rMuV-SH-C-flag and rMuV-SH-3stop-C-flag, were created. By inserting three stop codons in the SH gene, the latter virus cannot express the SH protein. In order to confirm the assumption of an anti-apoptotic feature of the SH protein, different cell lines (Vero and A549) were infected with rMuV-SH-C-flag or rMuV-SH-3stop-C-flag. By applying western blot analyses, apoptosis-kinetics based on the apoptosis specific cleavage of PARP were performed. To analyze the mumps virus’ influence on cellular signaling of infected cells an RT2 Profiling PCR Array was performed which is used to quantify the gene expression during the induction of apoptosis.
Western blot analyses of rMuV-SH-C-flag infected Vero and A549 cells showed a delayed cleavage of the apoptotic marker protein PARP compared to Vero and A549 cells infected with rMuV-SH-3stop-C-flag. Thus, SH protein inhibits the induction of apoptosis in mumps virus infected cells, which is further evidence for the anti-apoptotic functions of SH that have been reported previously. In addition, gene expression analyses of rMuV-SH-C-flag infected A549 cells delivered an upregulation of caspases-1, -7, and -4, as well as TNF-related factors (TNFSF10, TNFRSF1B, and TNF), and BIRC3. The regulation of apoptosis-related genes in mumps virus infected cells proves the apoptosis inducing features of the recombinant mumps virus and indicates a caspase-1 or TNF linked induction of apoptosis.
To extend the understanding of the mumps virus and to develop new therapeutic approaches, studying the exact mechanism during an infection is essential. The results of this thesis constitute a basis on which further analyses of the SH protein during the induction of apoptosis in infected cells can be built on.
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Generiert am 21.08.2017, 15:24:27