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Dissertation

Autor(en): Anja Zimmermann
Titel: Intrazellulärer Transport, Assembly und Egress des endogenen Betaretrovirus HERV-K113
Gutachter: Rupert Mutzel
Betreuer: Norbert Bannert
Hochschule: Freie Universität Berlin
Erscheinungsdatum: 01.10.2014
Volltext: pdf (urn:nbn:de:0257-10041752)
Fachgebiet(e): Medizin
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Abstract (ger):
Aufgrund der geringen Expression war das Studium des intrazellulären Transports von HERV-K(HML-2)-Proteinen und ihres Zusammenbaus zu viralen Partikeln bisher nicht möglich. Unbekannt waren deshalb auch die beteiligten Mechanismen. Die Klonierung eines Provirus mit revertierten, nicht-synonymen Mutationen und die Erhöhung der Expression ermöglichten die in dieser Arbeit auf Basis des HERV-K113-Elements erfolgten mikroskopischen Studien.
Für die lichtmikroskopische Darstellung des Polystrukturproteins Gag und des Hüllproteins Env wurden C-terminal markierte Konstrukte generiert. Es konnte gezeigt werden, dass fluoreszenzprotein-markiertes Gag nicht in der Lage ist zu viralen Partikeln zu assemblieren. Es treten aberrante Buddingstrukturen auf, die an der Zelloberfläche zu Plasmafortsätzen auswachsen. Um fluoreszenzmarkierte Partikel herzustellen ist ein Mischungsverhältnis von mindestens 1:5 mit nicht markiertem Gag nötig. Bei diesem Verhältnis wurden Partikel mit der erwarteten Morphologie generiert und deren Freisetzung und Reifung dokumentiert. Für gewöhnlich erfolgt die Freisetzung mit C-Typ- Morphologie. Eine starke Überexpression von Gag führte jedoch zur intrazellulären Akkumulation von unreifen Partikeln im Zytoplasma und somit zur A/B-Typ- Morphologie. Die Partikel lagern sich an die zytoplasmatischen Seite von Plasmamembran und Vesikeln an. Bezüglich des intrazellulären Transports stand HERV-K113 Gag mit Kompartimenten des endosomalen Stoffwechselwegs im Zusammenhang. Dies und die kinetischen Analysen von mobilen, intrazellulären Gag-Akkumulationen legen die Schlussfolgerung nahe, dass, wie auch bei anderen Retroviren, der endosomale Stoffwechselweg in den Transport und die Regulation des Gag-Transports involviert ist. Dabei spielen späte Endosomen und Lysosomen eine besondere Rolle.
Eine signifikante Kolokalisation von Gag und Env findet ausschließlich an der Plasmamembran statt und bestätigte damit die C-Typ-Assemblierung von HERV-K(HML-2). Durch eine verstärkte Expression von Env wurde zudem ein gesteigerter Einbau des C-terminal markierten Hüllproteins in virale Partikel erreicht. Das ermöglicht zusammen mit der Gag-Env-Zweifachmarkierung zukünftige, lichtmikroskopische Infektionsstudien mit HERV-K(HML-2).
Im Zuge der Arbeit wurden darüber hinaus zwei kleine, C-terminal im Gag gelegene Glutamin(Q)- und Prolin(P)-reiche Proteine (QP1 und QP2) entdeckt, die bis dato noch unbekannt waren. Mikroskopische Untersuchungen konnten eine Funktion in der späten Replikationsphase nicht belegen, bilden aber die Grundlage weiterführender Studien.
Abstract (eng):
The pure expression of the HERV-K(HML-2) proteins obstructed up until now the study of the intracellular transport and assembly of viral particles. To gain insight into these mechanisms a HERV-K113 provirus was cloned containing revertive non-synonymous mutations. The resulting increase of viral protein expression allowed for the first time to study in detail the late phase of viral replication using microscopy.
For light microscopic representation of the polyprotein Gag and the envelope protein Env C-terminal labeled constructs were generated. It was shown, that fluorescence labeled Gag is not able to assemble to viral particles. Instead, aberrant budding structures were observed forming tubular plasma extensions at the cell surface. Our studies revealed, that the generation of fluorescent viral particles showing the common viral particle morphology was achieved, when mixing fluorescently labeled and non-labeled Gag proteins in a ratio of 1:5. These C-type particles were released and mature. However, a high level of Gag overexpression leads to an intracellular accumulation of immature particles in the cytoplasm of the transfected cells. These particles showing a A/B-type morphology accumulated at the cytoplasmic side of the plasma membrane and vesicles. Additionally, HERV-K113 Gag was associated with compartments of the endosomal metabolic pathway for intracellular transport. These localization patterns and the kinetic analysis of the mobile intracellular Gag fractions lead us to the conclusion, that the endosomal pathway is involved in the regulation of Gag transport where late endosomes and lysosomes playing a major role.
A significant colocalization of Gag and Env takes place exclusively at the plasma membrane confirming the C-Type assembly of HERV-K(HML-2).Through an intensified expression of Env, we were able to induce an increased incorporation of the C-terminal labeled envelope protein. In the future, this will allow together with a double labeling of Gag and Env infections studies of HERV-K(HML-2) via light microscopy.
Within the scope of these studies, we also identified two small, so far unknown glutamine (G) and proline (P) rich proteins (QP1 and QP2) located at the C-terminus of Gag. The microscopic studies could not identify a potential role in the late phase of viral replication. But these data will be the basis for further investigations in the future.
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Generiert am 19.11.2017, 03:51:18