http://edoc.rki.de/176904/51 2026-04-19T14:18:14Z 2026-04-19T14:18:14Z Friedrich, Josephine http://edoc.rki.de/176904/8426 2021-07-13T12:20:07Z 2021-06-24T00:00:00Z

Analyse der Restriktion des Humanen Endogenen Retrovirus-K(HML-2) durch das Protein IFI-16 Friedrich, Josephine Ein Immunsensor für intrazelluläre DNA und viraler Restriktionsfaktor ist das IFI16-Protein. Zu Beginn dieser Arbeit erfolgte der Nachweis der 13-fachen Hemmung der Viruspartikelproduktion von HERV-K(HML-2) durch IFI16. Verwendet wurde dabei der Molekularklon eines rekonstruierten HERV-K113-Provirus, welcher ein vollständiges Provirus-Genom mit offenem Leserahmen für alle viralen Gene und intakte LTR-Sequenzen besitzt. Als Indikator für die virale Partikelproduktion diente die Aktivität der Reversen Transkriptase, die mithilfe des PERT-Assays bestimmt werden konnte. Der Austausch der U3-Region der 5‘LTR mit einem CMV-Promotor resultierte in Außerkraftsetzen der Restriktion. Aufgrund dieser Tatsache wurden im Laufe dieser Arbeit verschiedene Konstrukte generiert, die ermöglichten, die Rolle der LTRs bei der Hemmung von HERV-K113 durch IFI16 zu analysieren. Zu Beginn erfolgte hierfür das Klonieren diverser Luciferase-Konstrukte, die sowohl die Möglichkeit boten, den Effekt von IFI16 auf die alleinstehende 5’LTR und 3’LTR als auch die vollständige LTR von HERV-K113 zu untersuchen. Die Verwendung dieser Luciferase-Konstrukte resultierte jedoch nicht in der Beantwortung der Frage nach der Rolle der LTRs bei der Hemmung von HERV-K113, da keine signifikanten Unterschiede zwischen der entsprechenden Kontrolle und dem IFI16-Expressionsplamid detektiert werden konnten und des Weiteren IFI16 in einigen Zelllinien trotz hoher Transfektionsrate nicht erfolgreich exprimiert wurde. Daher wurden zur Identifikation des funktionellen Bereichs des viralen Genoms, an dem IFI16 seine hemmende Wirkung entfaltet, ergänzende HERV-K(HML-2)-Konstrukte kloniert, die ermöglichen, sukzessiv den Bereich der 5‘ LTR oder der 3’LTR einzugrenzen. Die gewonnenen Daten stützen die Annahme, dass für die Restriktion von HERV-K113 die LTR eine essenzielle Rolle spielt, waren jedoch nicht in der Lage, den dabei funktionellen Bereich des Genoms näher einzugrenzen. Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Masterarbeit humane Zelllinien bezüglich ihrer Transfektionseffizienz und hinsichtlich ihrer Volllängen- oder Teil-IFI16-Expression untersucht. Hierbei sind besonders die überzeugenden Daten der Hek293-T und HeLa-Zellen zu erwähnen. Zudem wurde nachgewiesen, dass der Bereich des IFI16-Proteins, welcher lediglich die Pyrindomäne plus Linkerbereich umfasst, zur HERV-K(HML-2) Hemmung ausreicht. Dieser Bereich wurde abschließend in einen bicistronischen lentiviralen Vektor kloniert, damit Reporterviren generiert und die Transduktionseffizienz verschiedener humanen Zelllinien bestimmt.; An immune sensor for intracellular DNA and viral restriction factor is the interferon-inducible protein 16 (IFI16). At the beginning of this work, the 13-fold inhibition of the viral particle production of HERV-K(HML-2) by IFI16 was demonstrated using the molecular clone of a reconstituted HERV-K113 provirus, which has a complete provirus genome with open reading frame for all viral genes and intact LTR sequences. Within this master thesis, the activity of reverse transcriptase served as an indicator of viral particle production, which could be determined by using a PERT assay. The exchange of the U3-region of the 5’LTR with a CMV-promoter resulted in the annulment of the restriction. Based on this fact, different constructs were generated during this thesis, which made it possible to analyze the role of the LTR in the inhibition of HERV-K113 by IFI16. Initially, this was done by cloning various luciferase constructs that offered the possibility to study the effect of IFI16 on the stand-alone 5'LTR and 3'LTR as well as on the complete LTR of HERV-K113. However, the use of these luciferase constructs did not result in answering the question of the role of the LTRs in inhibiting HERV-K113, as no significant differences could be detected between the corresponding control and the IFI16 expression plasmid and, further, IFI16 was not successfully expressed in some cell lines despite a high transfection rate. Therefore, to identify the functional region of the viral genome at which IFI16 displays its inhibitory effect, complementary HERV-K(HML-2)-constructs were cloned that allowed successively narrowing down the region of the 5' LTR or the 3'LTR. The obtained data verified the assumption that for the restriction of HERV-K113 by IFI16 the LTR plays an essential role but was not able to further identify the functional region of the genome in more detail. In addition, human cell lines were analyzed in this master thesis regarding their transfection efficiency and their full-length or partial IFI16 expression. Here, the convincing data of Hek293T and HeLa cells are particularly worth mentioning. In addition, the region of IFI16 protein containing only the pyrin domain plus linker region was shown to be sufficient for HERV-K(HML-2) inhibition. This region was finally cloned into a bicistronic lentiviral vector to generate reporter viruses and to determine the transduction efficiency of various human cell lines.

2021-06-24T00:00:00Z Staudt, Lisa http://edoc.rki.de/176904/8425 2021-09-07T08:27:26Z 2021-06-24T00:00:00Z

Untersuchungen zur reversen Transkription und dem Kerneintritt von HERV-K(HML-2) Staudt, Lisa Das menschliche Genom besteht zu 8% aus retroviralen Sequenzen. Die Unterfamilie HML-2 von HERV-K ist dabei die einzige Linie, die seit der Divergenz zwischen Menschen und Schim-panse im menschlichen Genom repliziert hat. Viele der Loci sind in der menschlichen Popu-lation nicht fixiert, haben intakte Open Reading Frames (ORF) und wenig oder keinen Se-quenzunterschied zwischen den flankierenden LTRs, welche bei der Integration absolut iden-tisch sind (Belshaw und Tristem 2009). Trotzdem konnten bisher keine replikationskompeten-ten endogenen HERVs im menschlichen Genom identifiziert werden, was vermuten lässt, dass es einen Postentry/ Preintegration Block gibt. Zur genaueren Untersuchung möglicher Rest-riktionsprozesse von HERV-K(HML-2) wurden Methoden und Infektionsversuche etabliert, um Prozesse der Reversen Transkription und des Kerneintritts genauer zu analysieren. Um die Sensitivität für Infektionsexperimente zu verstärken, wurde hierfür zunächst das auf dem HERV-Kcon- Molekularklon codierte EGFP-Reportergen gegen die Luciferase ausge-tauscht. Anhand eines Infektionsexperimentes konnte für beide Reportersysteme gezeigt wer-den, dass bei den humanen Zelllinien HEK293T und HeLa eine stabile Reporteraktivität nach-gewiesen werden kann. Dies lässt nicht nur eine stabile Integration des Reportergens vermu-ten, sondern spricht auch dafür, dass Prozesse auf Ebene des Kerneintritts erfolgreich durch-laufen werden. Des Weiteren wurden die Reporterviren zur Identifikation zellulärer Restriktionsfaktoren ein-gesetzt. In Anlehnung an ein Infektionsexperiment von Kramer et al. sollte die Hypothese über-prüft werden, ob es zelluläre Restriktionen gegen HERV-K(HML-2) gibt, welche durch Koinfektion mit einem anderen Virus aufgehoben werden können. Der Effekt der Inhibitorsättigung, welcher in der Vergangenheit mit CMVoriLuc-basierten Reporterviren beobachtet wurde, konnte im Rahmen des Experiments mit HERV-Kcon nicht nachgewiesen werden (Kramer et al. 2016). Zudem wurden Prozesse auf Ebene der Reversen Transkription näher untersucht. Hierzu galt es virale cDNA als Produkt der reversen Transkription nachzuweisen. Um zu verhindern, dass anstatt viraler cDNA kontaminierende Plasmid-DNA detektiert wird, wurde eine kurze Markersequenz in die U3-Region der 3´LTR eingefügt. Da diese während der Reversen Transkription durch intramolekulare Umlagerungen verdoppelt wird, ist diese in der viralen genomischen cDNA sowohl in der 3´LTR, als auch 5´LTR vorhanden und unterscheidet sich damit von der Sequenz der Plasmid-DNA. Mit dieser Methode konnte gezeigt werden, dass spezifisch virale cDNA in HEK293T nachgewiesen werden kann und die Mutation in der U3-Region als ein geeignetes Tool für den Nachweis viraler cDNA dient. Die Vermutung über Restriktionen auf Ebene der Reversen Transkription können damit für die humane Zelllinie HEK293T widerlegt werden.; The human genome consists of 8% retroviral sequences. The HML-2 subfamily of HERV-K is the only lineage that has replicated in the human genome since the divergence between humans and chimpanzees. Many of the loci are not fixed in the human population, have intact open reading frames (ORF) and little or no sequence difference between the flanking LTRs, which are absolutely identical upon integration (Belshaw und Tristem 2009). Despite numerous studies, no replication-competent endogenous HERVs have yet been identified in the human genome, suggesting that there is a post-entry/pre-integration block. To precisely study possible restriction processes of HERV-K(HML-2), methods and infection experiments were established to analyze the process of reverse transcription and nuclear entry. To improve the sensitivity for infection experiments, the EGFP-reporter gene encoded on the HERV-Kcon molecular clone was exchanged for the luciferase gene. Based on a long-term infection experiment, it was successfully demonstrated for each reporter system that stable reporter activity can be detected in the human cell lines HEK293T and HeLa. This not only indicates a stable integration of the reporter gene, but also suggests that processes at the level of nuclear entry are being successfully completed. Furthermore, the reporter viruses were used to identify cellular restriction factors. In accordance with an infection experiment by Kramer et al., the hypothesis was verified whether there are cellular restrictions against HERV-K(HML-2), which can be abrogated by coinfection with another virus. The effect of inhibitor saturation, which was observed in the past with CMVoriLuc-based reporter viruses, could not be demonstrated in the infection experiment with HERV-Kcon (Kramer et al. 2016). In addition, processes at the level of reverse transcription were investigated. The aim was to detect viral cDNA as a product of reverse transcription. To prevent contaminating plasmid DNA from being detected instead of viral cDNA, a short marker sequence was inserted into the U3-region of the 3'LTR. Since the mutated sequence is duplicated during reverse transcription by intramolecular rearrangements, it is present in both, the 3'LTR and 5'LTR, and can thus be distinguished from the contaminating plasmid DNA. This method successfully demonstrated that the mutation in the U3-region is an effective tool to specifically detect viral cDNA by a PCR system. The hypothesis about restrictions at the level of reverse transcription can thus be disproved for the cell line HEK293T.

2021-06-24T00:00:00Z Savas, Aylin http://edoc.rki.de/176904/8424 2021-07-13T12:20:07Z 2021-06-24T00:00:00Z

Inhibition von Betaretroviren durch das interferoninduzierte Protein IFI16 Savas, Aylin Neben der Funktion als Immunsensor besitzt das interferon-induzierte Protein 16 (IFI16) auch eine hemmende Wirkung auf verschiedene Viren, die noch wenig verstanden ist. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die antivirale Wirkung von IFI16 auch bei Betaretroviren, insbesondere dem humanen endogenen Retrovirus K (HML-2) auftritt. Die HERV-K(HML-2)-Familie ist die jüngste Familie der HERVs und enthält mitunter weitgehend intakte Proviren, die offene Leserahmen für alle viralen Genprodukte besitzen. Für diese Arbeit wurde ein Molekularklon verwendet, in welchem alle postinsertionalen Mutationen, die sich vermutlich im Laufe der Evolution angesammelt haben, revertiert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass IFI16 in der Lage ist, HERV-K113, ein Mitglied der HERV-K(HML-2)-Familie zu hemmen, was durch die Aktivität der Reversen Transkriptase in den Überständen der transfizierten Zellen bewertet wurde. Durch die Untersuchung eines CMV-HERV-K113-Konstruktes, welches anstelle der U3- Region der LTR einen CMV-Promotor besitzt, konnte gezeigt werden, dass die virale LTR eine wichtige Rolle für die Hemmung durch das IFI16 spielt. Eine virale Restriktion des Jaagsiekte- Schaf-Retrovirus (JSRV) und des Maus-Mammatumor-Virus (MMTV) durch IFI16 konnte nicht gezeigt werden. Für die Analyse standen jedoch nur Konstrukte zur Verfügung, die nicht die gesamte virale LTR enthalten. Aus diesem Grund ist es trotz der Ergebnisse mit den vorhandenen Konstrukten weiterhin recht wahrscheinlich, dass das IFI16 in der Lage ist, die virale Partikelproduktion dieser Viren zu inhibieren, denn JSRV und MMTV sind dem HERVK( HML-2) sehr ähnlich und gehören wie diese ebenfalls zu den Betaretroviren. Das Kernlokalisierungssignal des IFI16 ist essenziell für seine antivirale Wirkung, wodurch begründet werden kann, dass die Hemmung durch IFI16 im Kern der Zelle stattfindet. Die HIN-Domänen des IFI16 sind im Gegensatz dazu nicht von Belang, was die antivirale Funktion des Proteins betrifft, denn die Pyrin-Linker-Domäne des IFI16 war ausreichend für den antiviralen Effekt. Bei Transfektion des Molekularklons oriST-HERV-K113 und einer späteren Transfektion des IFI16 konnte keine Hemmung mehr gezeigt werden, wonach die Hemmung des IFI16 vermutlich in den frühen viralen Replikationsschritten ansetzt. Wurde das IFI16 in den Zellen, welche mit oriST-HERV-K113 transfiziert wurden, bereits vorher transfiziert, wurde entgegen der Erwartungen keine verringerte virale Partikelproduktion gemessen. Dieser Umstand lässt vermuten, dass nur durch die gleichzeitige Transfektion der Plasmide gesichert werden kann, dass die Zellen beide Plasmide aufnehmen und exprimieren. Durch die Infektion von Zellen, die zuvor mit IFI16 transfiziert wurden, mit einem HERV-GFP-Reportervirus, konnte außerdem gezeigt werden, dass das IFI16 keinen Einfluss auf den Einbau des Virusgenoms in das Genom der Zellen hat und somit seine Hemmung erst nach dem Einbau entfaltet.; Aside from its function as an immune sensor, the interferon-inducible protein 16 (IFI16) has an antiviral effect on different viruses. In this work the antiviral effect of IFI16 on betaretroviruses was determined, particularly on the human endogenous retrovirus K (HML-2). The HERVK( HML-2) family is the youngest family of HERVs and occasionally includes intact proviruses with open reading frames for all viral gene products. The molecular clone of HERV-K113, which was used for this work, is a construct, where all postinsertational mutations were reverted. The results show that IFI16 is able to inhibit HERV-K113, a member of the HERV-K(HML-2) family. The inhibition was determined by the activity of the reverse transcriptase in the supernatant of the transfected cells. Analysis of a CMV-HERV-K113 construct, where the U3 region is replaced by a CMV promotor, showed that the viral LTR is important for the inhibition by IFI16. If the U3 region is replaced, the inhibition of HERV-K113 is much lower than the inhibition of the construct with the complete LTR. Analysis of the Jaagsiekte Sheep Retrovirus (JSRV) and the Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV) showed no inhibition by IFI16. For this experiment there were only constructs available, in which the U3 region of the viral LTR is replaced by a CMV promoter. Therefore, it is still likely that IFI16 is able to restrict JSRV and MMTV in the presence of a full viral LTR. The nuclear localization signal is essential for the antiviral effect of IFI16, whereby it was shown that the restriction takes part in the nucleus of the cell. In contrast, the HIN domains seem to be dispensable, because the pyrin-linker domain of the IFI16 is sufficient for the restriction of HERV-K113. If the molecular clone oriST-HERV-K113 was transfected and the IFI16 was cotransfected at later points in time, the antiviral effect was gone, so it seems like the inhibition takes part in the early steps of viral replication. If the IFI16 was transfected first and the oriST-HERV-K113 was cotransfected at later points in time, there was, contrary to expectations, no antiviral effect. It seems like only simultaneous transfection of both plasmids can guarantee that the cells incorporate and express both plasmids. Furthermore, 293T cells were transfected with IFI16 and later infected with a HERV-GFP reportervirus. The results indicate that the infection of the cell and the integration of the viral genome into the genome of the host cell is not inhibited by IFI16 and thereby the viral restriction seems to appear after integration.

2021-06-24T00:00:00Z Al-shehabi, Hussein http://edoc.rki.de/176904/8423 2021-07-13T12:20:19Z 2021-06-24T00:00:00Z

The role of human SAMHD1 in restricting porcine endogenous retroviruses (PERVs) and the innate immune response to PERV infection in human primary immune cells Al-shehabi, Hussein Die Freisetzung von Porcinen Endogenen Retroviren (PERVs) aus Schweinezellen ist ein potenzieller Risikofaktor während der Xenotransplantation. PERV ist in der Lage, in humanen Zelllinien zu replizieren. Mögliche Abwehrmechanismen gegen die PERV-Replikation sind zelluläre Restriktionsfaktoren. Dazu gehört SAMHD1, eine Triphosphohydrolase, die den zellulären dNTP Pool in sich nicht teilenden Zellen erschöpft und die reverse Transkription damit verhindert. Restriktionsfaktoren und die angeborene Immunität sind die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Krankheitserreger. Die Erkennung viraler Strukturen führt oftmals zur Produktion von Typ-I-Interferonen und nachfolgend zur Expression von IFN-stimulierten Genen. Der erste Teil dieser Arbeit fokussiert auf den Nachweis der antiviralen Aktivität von SAMHD1 gegen rekombinante PERV-A/C in menschlichen Immunzellen. Um dies zu untersuchen, wurden diese Viren aus aktivierten PBMCs von Schweinen gewonnen, um humane Primärzellen von gesunden Spendern zu infizieren. Parallel dazu wurden Primärzellen mit virusähnlichen Partikeln transduziert, welche zum Teil zusätzlich das Vpx- Protein von SIVmac239 enthielten. Das Ergebnis zeigte, dass SAMHD1 die reverse Transkription von PERV-A/C in menschlichen Monozyten, von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (MDDC), Makrophagen (MDM) oder ruhenden CD4+ T-Zellen und in monozytischen THP-1-Zellen wirksam einschränkt. Die Degradation von SAMHD1 durch SIVmac Vpx oder CRISPR/Cas9-Knock-out von SAMHD1 ermöglichte die reverse Transkription von PERV. Die Zugabe von Deoxynukleosiden milderte die SAMHD1- vermittelte Restriktion, was darauf hindeutet, dass der SAMHD1-vermittelte Abbau von dNTPs die PERV-Replikation in diesen menschlichen Immunzellen einschränkt. Im zweiten Teil dieser Studie erfolgte die Untersuchung der IFN-Reaktion durch Analyse der Induktion von IFN-stimulierten Genen in humanen Primärzellen nach Infektion durch PERVA/ C. Die Ergebnisse zeigen, dass PERV-A/C die CXCL-10-Produktion in humanen MDDCs, Monozyten und MDMs über 100-fach erhöht. Aufgrund der profunden Inhibition dieser Aktivierung mit dem JAK-Inhibitor (AT9283) wird daraus geschlossen, dass dieser Signalweg für die CXCL-10 Induktion bei einer PERV-A/C Infektion in humanen myeloischen Zellen verantwortlich ist. Die erhaltenen Ergebnisse belegen dass SAMHD1 ein potenzielles Hindernis für die Übertragung von PERV-A/C von Schweinetransplantaten auf Menschen während der Xenotransplantation darstellt.; The release of porcine endogenous retrovirus (PERV) particles from pig cells is a potential risk factor during xenotransplantation by way of productively infecting the human transplant recipient. Potential countermeasures against PERV replication are restriction factors, such as SAMHD1, that block retroviral replication. SAMHD1 is a triphosphohydrolase that depletes the cellular pool of dNTPs in non-cycling cells preventing retroviral reverse transcription. Restriction factors and innate immune responses are the first line of defense against invading pathogens. Sensing of viruses in a cell usually results in the production of type I IFNs that lead to the activation of IFN-stimulated genes. The first part of this study focuses on the analysis of the antiviral activity of SAMHD1 against PERV-A/C in human immune cells. To study that, PERV-A/Cs originating from activated porcine PBMCs was used to infect human primary cells from healthy human donors. In parallel, primary cells were transduced with virus-like particles (VLPs) lacking or containing the Vpx protein from SIVmac239. The result showed that SAMHD1 potently restricts PERVA/ C reverse transcription in human monocytes, monocyte-derived dendritic cells (MDDC), macrophages (MDM) or resting-CD4+ T-cells and in monocytic THP-1 cells. Degradation of SAMHD1 by SIVmac Vpx or CRISPR/Cas9 knock-out of SAMHD1 allowed for PERV reverse transcription. Addition of deoxynucleosides alleviated the SAMHD1-mediated restriction suggesting that SAMHD1-mediated degradation of dNTPs restricts PERV replication in these human immune cells. The aims in the second part of this study were to investigate the IFN response by monitoring induction of IFN stimulated genes following infection by PERV-A/Cs, and to identify the signaling pathways, which play a role in the type I IFNs response. The results showed that PERV-A/C increased (over 100-fold) CXCL-10 production in human MDDCs, monocytes and MDMs compared with non-infected cells or heat-inactivated virus. Treatment with VLP+Vpx or empty VLP did not cause more CXCL-10 induction compared with untreatment. The JAK-inhibitor (AT9283) reduced the CXCL-10 induction in infected cells indicating that the JAK/STAT pathway is activated by PERV-A/C infection of primary human myeloid cells. In conclusion, the findings in this work highlight SAMHD1 as a potential barrier to PERVA/ C transmission from pig transplants to human recipients during xenotransplantation.

2021-06-24T00:00:00Z