http://edoc.rki.de/176904/50 Wed, 11 Mar 2026 10:08:34 GMT 2026-03-11T10:08:34Z http://edoc.rki.de/176904/5417 Detection of DNA intermediates of the reverse transcription during the infection process of the human endogenous retrovirus-K (HML-2) Volkwein, Alexander Endogenous retroviruses form part of the genome of many vertebrates. In humans they account for approximately 8 % of the entire genetic information. Along evolution the proviral sequences have been mutated until nowadays there is no known HERV able to express infectious particles. However the youngest and probably therefore the less mutated family, HERV-K (HML-2), preserves proviruses able to produce functional proteins. Although it has been shown that not only the glycoproteins responsible for mediating entry have been mutated, but also integration of the viral genes in the host genome will not be properly accomplished. In order to determine potential inhibited stages of this process, HERV-K pseudotyped viral particles able to mediate penetration of the cell membrane were successfully produced and monitored during reverse transcription on their course towards integration. For this purpose several set of primers were designed, that bind specific to different stages along the reverse transcription process. Using these primers reverse transcribed DNA could be detected. Consequently, analysis of these characteristics steps could ideally help to detect at some point of significant less cDNA, which may permit to infer the phase where inhibition takes place. Wed, 04 Mar 2015 00:00:00 GMT http://edoc.rki.de/176904/5417 2015-03-04T00:00:00Z http://edoc.rki.de/176904/5389 Hemmung der Expression von HIV und porcinen endogenen Retroviren mittels RNA-Interferenz Votteler, Jörg Im Genom von Schweinen befinden sich provirale Sequenzen von porcinen endogenen Retroviren (PERVs), welche replikationskompetente Viren codieren. Die Sequenz eines A/C-rekombinanten PERV, bestehend aus dem gag/pol-Bereich von PERVC und dem env-Gen von PERV-A, wurde kloniert. Damit konnte zum ersten Mal das gesamte Genom dieses rekombinanten Subtyps sequenziert und analysiert werden. Zudem handelte es sich um ein auf humanen Zellen adaptiertes Virus, welches durch den Einbau zusätzlicher repetitiver Elemente in die LTR einen höheren Virustiter erreicht. In Zellen, die mit den Molekularklonen transfiziert wurden, konnten die VolllängenmRNA sowie die gespleißte env-mRNA nachgewiesen werden. Ebenfalls wurde das virale Gag-Protein und die reverse Transkriptase detektiert. Die Produktion infektiöser Partikel konnte bislang nicht nachgewiesen werden, die Ursachen werden analysiert. Um die Expression von PERV und HIV mittels RNA-Interferenz zu hemmen, wurden shRNA-Expressionskassetten gegen Target-Sequenzen innerhalb der viralen mRNAs in Vektoren kloniert. Es konnte gezeigt werden, das mittels RNA-Interferenz die Expression von HIV-1 unterdrückt wird. Expressionskassetten mit shRNAs gegen die HIV-1-Gene gag und rev wurden in konventionelle Expressionsvektoren kloniert. In HIV-1-infizierten HeLa-P4- und C8166-Zellen konnte mit diesen Konstrukten eine deutlich Reduktion der viralen Replikation erreicht werden. Auch mit den lentiviralen Konstrukten gegen HIV-1-rev und -tat war eine deutliche Hemmung der HIV-1-Expression messbar. Durch den Einbau von Fehlpaarungen in das 3´-Ende des Sense- Stranges konnte die Effizienz der shRNAs nicht gesteigert werden. Zur Hemmung der PERV-Expression wurden ebenfalls lentivirale Vektoren generiert, welche eine shRNA-Expressionskassette gegen eine im pol-Gen von PERV befindliche Sequenz trugen. Mit diesen Konstrukten wurden porcine Fibroblasten transduziert. Zum ersten Mal konnte eine Hemmung der Expression von PERV in primären Schweinezellen gezeigt werden. Mit diesen lentiviralen Konstrukten wäre es möglich, transgene Schweine zu erstellen, in deren Zellen die virale Expression herunterreguliert ist, wodurch diese Schweine eine erhöhte Sicherheit vor einer Infektion mit PERV bei einer Xenotransplantation bieten könnten. Sun, 01 Aug 2004 00:00:00 GMT http://edoc.rki.de/176904/5389 2004-08-01T00:00:00Z http://edoc.rki.de/176904/5388 Porzine endogene Retroviren (PERVs): In vitro-Infektionsversuche und Adaptation an humane Zellen Voigt, Katrin In dieser Arbeit wurde die Infizierbarkeit von humanen lymphoiden Zellen mit PERV untersucht. Dabei konnte zum ersten Mal eine Infektion von T-Zellen gezeigt werden, die nicht nur durch eine Provirusintegration charakterisiert ist, sondern auch durch eine Virusproduktion. Ähnlich wie bei anderen humanen lymphoiden Zellen ist die Virusreplikation gering. In Ergänzung zu bereits durchgeführten Adaptationsversuchen mit einer PERV-A/C-Rekombinante und einer Mischpopulation aus PERV-A und PERV-B wurde hier die Adaptation der beiden Subtypen PERV-A und PERV-B an die humane Nierenzell-Linie 293 jeweils unabhängig voneinander untersucht. Bei dem PERV-A-Klon wurde mit jeder Passage eine Verlängerung der LTR festgestellt, sowie eine Erhöhung der RT-Aktivitäten und des Titers beobachtet. Dagegen wurde bei dem PERV-B-Klon keine Verlängerung der LTR beobachtet. Obwohl die RT-Aktivität nicht zunahm wurde dennoch eine Zunahme des Virustiters festgestellt. Die Sequenzen der LTR der seriell passagierten PERV-A/C-Klone weisen Multimerisierungen auf, welche Transkriptionsfaktorbindestellen (z.B. NFY) enthalten. Um den Einfluss der Sequenzwiederholungen auf die Virusreplikation zu untersuchen, wurde die 5´-LTR verschiedener PERV-Klone unterschiedlicher Passagen kloniert und sequenziert, und für Expressionsstudien in einem dualem Luziferase-Expressionssystem vorbereitet. Untersuchungen von mit PERV verwandten Retroviren zeigten, dass Multimerisierungen derartiger Sequenzen in der LTR nicht nur mit einer Steigerung der Virusreplikation, sondern auch mit einem erhöhtem Tumorrisiko assoziiert ist. Für eine entgültige Einschätzung des Infektionsrisikos durch PERV bei der Xenotransplantation müssen weitere Untersuchungen in vitro, aber insbesondere in vivo durchgeführt werden, um eine Gefährdung der Transplantatrezipienten durch Immundefizienzen und Tumore auszuschließen und eine Übertragung der Viren auf Dritte zu vermeiden. Wed, 01 Aug 2001 00:00:00 GMT http://edoc.rki.de/176904/5388 2001-08-01T00:00:00Z http://edoc.rki.de/176904/5387 Die Induktion von CD4+ CD25+ regulatorischen T-Zellen durch transmembrane Hüllproteine von Retroviren Thi, Viet Loan Dao Retrovirale Infektionen sowie retroviral bedingte Tumorentwicklungen sind häufig begleitet von schweren, meist lethal verlaufenden Immunsuppressionen. Bisher ist der Mechanismus der induzierten Immundysfunktion allerdings weitgehend ungeklärt. Aufgrund des hohen Konservierungsgrades der an dem Fusionsprozess beteiligten transmembranen Hüllproteine liegt es nahe, dass diese eine distinkte Rolle bei der induzierten Fehlfunktion des Immunsystems spielen und tatsächlich konnten erste Hinweise erbracht werden, dass die retroviralen TMProteine immunsuppressive Wirkungen in vitro haben. Anfang des letzten Jahrzehnts wurde eine neue Population an suppressiv aktiven T-Zellen identifiziert, die so genannten CD4+CD25+Foxp3+ regulatorischen T-Zellen, für die eine Beteiligung an retroviral bedingten Immundysfunktionen nachgewiesen werden konnte. Um den Mechanismus der Immunsuppression zu untersuchen, wurden unterschiedliche retrovirale Proteine hergestellt und auf ihr Potential, regulatorische T-Zellen in vitro zu induzieren, überprüft, um so Rückschlüsse auf in vivo Funktionen während einer Infektion bzw. der Tumorigenese ziehen zu können. Exemplarisch für ein Gammaretrovirus wurde eine mittels Saccharose-Gradienten separierte PERV-Präparation hergestellt, welche in der Lage war, in vitro die IL-10 Sekretion von humanen PBMCs zu stimulieren und eine Erhöhung in der CD4+CD25+FoxP3+ Population zu induzieren. Um diese Wirkungen zu spezifizieren, wurde das TM-Protein von HERV-K erstmals rekombinant in einem eukaryotischen Expressionssystem endotoxinfrei hergestellt und ebenso in vitro untersucht. Dieses zeigte im Vergleich zur Virus-Präparation höhere, dosisabhängige Tregspezifische Wirkungen, wie eine starke IL-10 Sekretion, einen Anstieg in der CD4+CD25+FoxP3+ Population und eine Induktion weiterer antiinflammatorischer Zytokine wie IL-6 und TGF-β humaner PBMCs sowie eine Inhibition der Mitogen-induzierten Proliferation muriner Lymphozyten. Die TM-Proteine verschiedener Retroviren enthalten einen hochkonservierten Bereich, für den, unabhängig von den restlichen viralen Proteinen, immunsuppressive Eigenschaften nachgewiesen werden konnten, die so genannte ISU-Domäne. Diese wurde synthetisch mittels Kopplung hergestellt und darauf überprüft, ob sie gesondert in der Lage ist, regulatorische T-Zellen zu induzieren. Ein Heteropolymer, synthetisiert aus Monomeren der ISUDomänen von HIV und MuLV, hat, analog zu den Untersuchungen der Viruspräparation und des TM-Proteins, in vitro konzentrationsabhängig die IL-10 Sekretion humaner PBMCs, eine geringe Erhöhung in der CD4+CD25+FoxP3+ Population, sowie eine Inhibition der Proliferation muriner Lymphozyten induziert. Durch den Nachweis, dass die TM-Proteine von Retroviren in vitro Tregs induzieren können, wurde ein erster Hinweis auf eine in vivo Induktion und somit ein Beitrag zum Verständnis der Immunpathogenese während einer retroviralen Infektion bzw. einer endogen retroviral bedingten Tumorentwicklung erbracht. Wed, 01 Nov 2006 00:00:00 GMT http://edoc.rki.de/176904/5387 2006-11-01T00:00:00Z