Erkennung von Regulationssequenzen für die Transkription in heterologen Systemen

Abstract

Mit dieser Arbeit sollte die Spezifität von Promotoren analysiert und ihre Funktionalität über `kingdom´-Grenzen hinaus untersucht werden. Hierfür wurden zwölf pflanzenspezifische Promotoren, welche in der Gentechnik zur Herstellung von transgenen Pflanzen eingesetzt werden, auf Genexpression in fünf Bakterienarten untersucht. Die Bakterienarten, in denen die pflanzenspezifischen Promotoren untersucht wurden, stellten mit Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas putida und Acinetobacter sp. Vertreter taxonomisch unterschiedlicher Gruppen dar. Auch die untersuchten pflanzenspezifischen Promotoren stammten aus phylogenetisch nicht-verwandten Gruppen wie Pflanzen, Pflanzenviren und Agrobakterien. Weiterhin wurden drei bakterielle und sechs Plastiden Promotoren auf Genexpression in Nicotiana tabacum untersucht. Die drei bakteriellen Promotoren stammten aus E. coli und Streptococcus faecalis, die Plastiden Promotoren aus N. tabacum. Die pflanzenspezifischen Promotoren wurden zur Quantifizierung der Expression mit den promotorlosen luxAB-Genen aus Vibrio harveyi und dem promotorlosen cat-Gen fusioniert. Die Frequenz mit der die pflanzenspezifischen Promotoren in den untersuchten Bakterienarten zu einer Expression führten, war mit einer Expressionsrate von 50 % der getesteten Kombinationen sehr hoch. Für einen Promotor (P), den P ST-LS1 aus Solanum tuberosum, wurde eine Expression in allen fünf untersuchten Bakterienarten nachgewiesen. Zwei der getesteten pflanzenspezifischen Promotoren, P RolC aus Agrobacterium rhizogenes und P 247 aus N. tabacum zeigten keine Expression der luxAB-Gene in den untersuchten Bakterienarten. Für zwei pflanzenspezifische Promotoren, P ST-LS1 und P Nos aus A. tumefaciens erfolgte für E. coli der Nachweis der phänotypischen Relevanz der heterologen Genexpression, da diese ein Wachstum auf Agarplatten mit einer gängigen Selektionskonzentration von Chloramphenicol ermöglichten. Die Charakterisierung der mRNA-Transkripte ausgewählter Fusionen der pflanzenspezifischen Promotoren mit den Reportergenen zeigten eindeutig, dass für die Transkriptionsinitiation durch die bakterielle RNA-Polymerase Sequenzelemente der pflanzenspezifischen Promotoren genutzt wurden. In zwei Fällen, dem P 35S aus Cauliflower Mosaic Virus und P Nos, wurde die pflanzliche TATA-Box zur Transkriptionsinitiation in E. coli genutzt. Eine genaue Charakterisierung der durch die bakterielle RNA-Polymerase genutzten –10-Region in dem P ST-LS1 in E. coli und Acinetobacter sp. fand durch Mutagenese statt. Hierbei wurden sogenannte `down-Mutanten´ hergestellt, die in E. coli und Acinetobacter sp. eine Reduktion der Expression gegenüber dem Wildtyp-Promotor P ST-LS1 aufwiesen. Zur Untersuchung der Expression der mutagenisierten Promotoren und des Wildtyp-Promotors P ST-LS1 in N. tabacum wurden diese mit dem promotorlosen gus-Gen fusioniert. Die mutagenisierten Promotoren zeigten nach stabiler Integration in das Pflanzengenom von N. tabacum eine unverminderte Expression in bezug auf den Wildtyp-Promotor. Die bakteriellen und Plastiden Promotoren wurden zur Untersuchung der Expression in N. tabacum ebenfalls mit dem promotorlosen gus-Gen fusioniert. Die Untersuchung ergab nur in einem einzigen Fall von neun getesteten Promotoren, dem des Plastiden Promotors des accD-Gens eine sehr geringe transiente Expression. Diese Expression müßte durch die Herstellung stabiler transgener Pflanzen überprüft werden. Eine Vorhersage über das Ausmaß einer möglichen heterologen Expression nachgeschalteter Gene durch eine Computer-gestützte Suche nach potentiellen eukaryontischen bzw. prokaryontischen Konsensus Sequenzen in den verwendeten Promotoren konnte nicht getroffen werden.