Einfluss mykobakterieller Porine auf Wachstum und intrazelluläre Persistenz

Abstract

Die Gattung Mycobacterium beherbergt sowohl hoch pathogene als auch opportunistische oder apathogene Arten, die unterschiedliche Wachstumsraten aufweisen und außerdem sich in der Fähigkeit intrazellulär zu persistieren unterscheiden. Ein Hauptmerkmal der Virulenz von M. tuberculosis, dem Erreger der Tuberkulose im Menschen, ist die intrazelluläre Persistenz. Das Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob und inwiefern die Permeabilität der äußeren Membran von Mykobakterien die intrazelluläre Persistenz beeinflusst. Hierfür wurde das Porin MspA von M. smegmatis, welches in langsam wachsenden Mykobakterien nicht vorkommt, in M. bovis BCG expremiert. Die Quantifizierung des bakteriellen Wachstums auf Agarplatten zeigte einen deutlichen Wachstumsvorteil des M. bovis BCG Derivats, das mspA enthielt. Die Mutagenese von mspA mittels einer Transposon-Insertion zeigte, dass MspA den veränderten Phänotyp bedingte. Des Weiteren zeigte das M. bovis BCG Derivat mit MspA eine verbesserte intrazelluläre Persistenz in der murinen Makrophagen-Zelllinie J774A.1 und der humanen Lungenepithel-Zelllinie A549. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen führte die Deletion von mspA in M. smegmatis zu einer verbesserten intrazellulären Persistenz in A. castellanii und in murinen Knochenmarksmakrophagen. Die Deletion von mspA und dem homologen Poringen mspC in einem anderen Mutantenstamm von M. smegmatis führte zu langsamerem Wachstum in Flüssigkultur und verbesserter intrazellulärer Persistenz in der murinen Makrophagen-Zelllinie J774A.1, in A. castellanii und in murinen Knochenmarksmakrophagen. Die Komplementation der Mutation durch die Expression von mspA in den Mutantenstämmen führte zur Wiederherstellung des Wildtyp-Phänotyps. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Permeabilität der mykobakteriellen Zellwand die intrazelluläre Persistenz und die Wachstumsrate beeinflusst. Außerdem deuten diese Daten daraufhin, dass die Persistenz von Mykobakterien abhängig ist von der Balance zwischen der Abschottung gegenüber des feindlichen phagosomalen Milieus und der Aufnahme von benötigten Nährstoffen in dieser nährstoffarmen Umgebung. Weiterhin wurde das Gen porM1von M. fortuitum charakterisiert, das ein homologes Porin zu MspA kodiert. PorM1 konnte in allen untersuchten Stämmen von M. fortuitum und in zwei Stämmen der nahe verwandten und apathogenen Art M. peregrinum nachgewiesen werden. Die Expressionsanalyse von porM1 zeigte unterschiedliche Expressionsmuster innerhalb der untersuchten Stämme der M. fortuitum-Gruppe. Aufgrund der Fähigkeit von M. fortuitum intrazellulär persistieren zu können und aufgrund des Vorhandenseins von Porinen wie PorM1, stellt diese Art ein geeignetes Modell dar, um den Einfluss mykobakterieller Porine auf die Persistenz zu studieren.

The genus Mycobacterium comprises highly pathogenic as well as opportunistic or apathogenic species exhibiting a great variability with respect to their growth rates but also their ability to persist or multiply on the cellular level. Intracellular persistence is a key feature of virulence of M. tuberculosis, the causative agent of human tuberculosis. The intention of this work was to find out whether or to which degree the permeability of the mycobacterial outer membrane affects the intracellular persistence. For this purpose the major porin of M. smegmatis (mspA), which is lacking in slow-growing mycobacteria, was expressed in M. bovis BCG. Quantification of bacterial growth on agar plates demonstrated clearly increased growth of the M. bovis BCG derivative expressing MspA. Transposon mutagenesis proved the mspA gene to be responsible for the growth enhancement. Intracellular multiplication of the M. bovis BCG derivative in the mouse macrophage cell line J774A.1 and the human pneumocyte cell line A549 was also clearly enhanced. In contrast to this finding, deletion of mspA in M. smegmatis increased its intracellular persistence in A. castellanii and murine bone marrow macrophages. Deletion of mspA together with another homologous porin mspC in another mutant strain of M. smegmatis resulted in decreased growth in broth culture while it significantly enhanced intracellular persistence in murine bone marrow macrophages, the mouse macrophage cell line J774A.1 and A. castellanii, respectively. Complementation of deletions by expression of mspA in the porin mutant strains resulted in restoration of the wild type phenotype with respect to intracellular persistence. These data show that the permeability of the mycobacterial cell wall affects the intracellular persistence. These findings also suggest that intracellular persistence of mycobacteria depends, inter alia, on the balance between walling-off towards the hostile environment and the uptake of required compounds in the nutrient-depleted phagosomal environment. Furthermore, the gene porM1 encoding a porin homologous to MspA was characterized in M. fortuitum. PorM1 was present in different strains of M. fortuitum and in the closely related non-pathogenic M. peregrinum. Analysis of expression patterns of porM1 showed divergent expression profiles among the members of the M. fortuitum-group. Due to the ability of M. fortuitum to persist and due to the existence of porins like PorM1, this species represent an appropriate model to study the impact of mycobacterial porins on persistence.