Charakterisierung von Herpesviren bei Spendertieren für die Xenotransplantation: Identifikation von funktionalen Regulatorproteinen des porzinen lymphotropen Herpesvirus Typ-1 (PLHV-1)

Abstract

Bei der Nutzung von Schweinen als Organspender für die Xenotransplantation besteht das Risiko der Übertragung von porzinen Herpesviren auf den Menschen. Das porzine lymphotrope Herpesvirus Typ-1 (PLHV-1) ist eng mit einer lymphoproliferativen Erkrankung assoziiert, die nach Transplantation von Blutstammzellen in immunsupprimierte Schweine beobachtet wurde. Die durch PLHV-1 vermittelte porzine PTLD ähnelt der EBV-induzierten PTLD des Menschen, die in der Allotransplantation bei ca. 10% der Transplantatempfänger auftritt und häufig letal verläuft. Bei einer Xenotransplantation könnte PLHV-1 unter Immunsuppression reaktiviert werden und möglicherweise eine lymphoproliferative Erkrankung im Organrezipienten auslösen. Daneben wäre eine Reaktivierung von bereits im Menschen persistierenden Herpesviren durch PLHV-1 möglich. In Folge könnten kritisch verlaufende Sekundärinfektionen im Patienten auftreten, die den Erfolg der Xenotransplantation und die Gesundheit des Organrezipienten gefährden könnten. Zur Abschätzung des Gefährdungspotentials von PLHV-1 in der Xenotransplantation wurden putative immediate early-Proteine untersucht. Diese regulieren in Herpesviren den Übergang von der Latenz in die lytische Replikationsphase. Der ORF50 und ORFA6/BZLF1h von PLHV-1 zeigt Homologie zu den essentiellen Regulatorproteinen des EBV (BRLF1, BZLF1) bzw. HHV-8 (ORF50, K-bzip). Als drittes Gen in PLHV-1 wurde orf57 identifiziert, dessen Genprodukt in Herpesviren hochkonserviert ist und vorrangig als posttranskriptionaler Regulator der Genexpression wirkt. Es sollte geklärt werden, ob PLHV-1 ORF50, ORFA6/BZLF1h und ORF57 als Transkriptionsaktivatoren wirken bzw. den Übergang von der Latenz in die lytische Infektionsphase regulieren. ORF50 von PLHV-1 konnte als starker Transkriptionsaktivator der PLHV-1-Promotoren orfA6/BZLF1h, orf57, orf59, orf09/DNA-Polymerase und orf08/Glykoprotein B identifiziert werden. ORF50 zeigte außerdem eine geringe Autoaktivierung in 293-Graham- und PK15- Zellen. Die Stimulation dieser PLHV-1-Promotoren durch ORFA6/BZLF1h war dagegen gering. PLHV-1 ORF57 führte zu keiner Transaktivierung der PLHV-1-Promotoren orf50, orfA6/BZLF1h, orf57 und orf59. Bei Koexpression von ORF50 und ORFA6/BZLF1h wurde in Abhängigkeit von der Zelllinie und vom Promotor ein synergistischer oder antagonistischer Effekt auf die Promotoraktivität beobachtet. PLHV-1 ORFA6/BZLF1h führte zur Reduktion der ORF50-vermittelten Aktivierung des orfA6/BZLF1h-, orf57- und orf59-Promotors in 293- Graham-Zellen. Dagegen wurde die Aktivität des orf50-Promotors bei Koexpression von ORF50 und ORFA6/BZLF1h in 293-Graham-Zellen leicht verstärkt. In PK15-Zellen wirkten beide Proteine dagegen synergistisch bei der Aktivierung dieser PLHV-1-Promotoren. ORFA6/BZLF1h beeinflusst die Transkriptionsaktivität von ORF50 promotorabhängig. Eine direkte Assoziation zwischen ORF50 und ORFA6/BZLF1h konnte jedoch nicht gezeigt werden. Die Koexpression von ORF50 und ORF57 führte zu einer synergistischen Aktivierung des orfA6/BZLF1h-, orf50-, orf57- und orf59-Promotors in 293-Graham- und PK15-Zellen. Aufgrund unspezifischer Proteinbindungen in der Immunpräzipitation war ein Nachweis einer direkten Interaktion zwischen ORF50 und ORF57 nicht möglich. Untersuchungen zu einer Wechselwirkung zwischen PLHV-1 und EBV zeigten, dass EBV auf molekularer Ebene PLHV-1 transaktiviert. EBV BRLF1 führte zu einer starken Aktivierung der PLHV-1-Promotoren orf50, orf57 und orf59 in 293-Graham-Zellen. Dagegen war der Einfluss von EBV BZLF1 auf die PLHV-1-Promotoraktivität deutlich geringer. Während PLHV-1 ORF50 zu keiner Aktivierung der EBV-Promotoren orfBZLF1, orfBRLF1, orfBMLF1 und orfBMRF1 führte, induzierte ORFA6/BZLF1h eine schwache EBV-Promotoraktivität in 293-Graham-Zellen. Im Zellkultursystem führte die Überexpression von PLHV-1 ORF50 in EBV-positiven B-Zellen zu einer ca. 2-fachen Erhöhung der EBV-Kopienzahl. Eine deutlichere Steigerung (bis 5- fach) der Viruslast wurde in EBV-positiven B-Zellen gemessen, die mit EBV BZLF1 transfiziert worden waren. Die Stimulation der lytischen EBV-Replikation mit TPA erzielte den stärksten Effekt. In PLHV-3-positiven B-Zellen wurde durch Überexpression von EBV BZLF1 bzw. BRLF1 keine lytische PLHV-3-Replikation induziert. Die Expression von PLHV-1 ORF50 bzw. ORFA6/BZLF1h in diesen B-Zellen führte ebenfalls nicht zur Induktion des lytischen Infektionszyklus von PLHV-3. Auch eine Kokultivierung von EBV-positiven B-Zellen mit PLHV-3-positiven B-Zellen führte nicht zu einer Reaktivierung von EBV bzw. PLHV-3. Die im Rahmen dieser Doktorarbeit erzielten Ergebnisse leisten einen wichtigen Beitrag zur Virussicherheit in der Xenotransplantation. Der ORF50 von PLHV-1 ist mit großer Wahrscheinlichkeit der Haupttransaktivator für den Übergang von der Latenz in die lytische Replikationsphase. Die Untersuchungen zur Wechselwirkung von PLHV-1 mit humanen Herpesviren zeigen außerdem, dass eine gegenseitige Reaktivierung dieser Herpesviren im Xenotransplantat nicht ausgeschlossen werden kann. PLHV-1 stellt damit ein Risiko für den Organrezipienten in der Xenotransplantation dar. Daher sollten für die Transplantation von porzinen Organen nur PLHV-freie Schweine gezüchtet werden.

In xenotransplantation, the pig is the favoured animal as a donor of cells and organs for human transplants. There is the risk, that porcine viruses or other pathogens might be transferred through the xenotransplant to the human organ recipient and might adapt to the immunocompromised patient. The porcine lymphotropic herpesvirus 1 (PLHV-1) was found to be involved in the aetiology of a lymphoproliferative disease, affecting experimentally transplantated and immunosuppressed miniature swine. The PLHV-1-associated „posttransplantation lymphoproliferative disease (PTLD)“ resembles the EBV-associated PTLD. This human disease affects approximately 10% of solid organ transplant recipients. During xenotransplantation, PLHV-1 might be transferred to the human recipient and cause a lymphoproliferative disease. Potential interactions between PLHV-1 and persistent human herpesviruses might be possible, leading to graft rejection and transplant failure. Recombination of porcine herpesviruses with human herpesviruses might create new pathogens with consequences for the wide population. In PLHV-1, potential immediate early genes were identified with homology to well known transacticator genes of EBV and HHV-8. PLHV-1 ORF50 and ORFA6/BZLF1h are homologues to BRLF1/ORF50 and BZLF1/K-bzip of EBV and HHV-8. The ORF50- homologues proteins are the main transcriptional activators for the switch from latent to lytic viral replication in different herpesviruses. The ORF57 of PLHV-1 shows weak homology to BMLF1/ORF57 of EBV and HHV-8, acting as a post-transcriptional activator of gene expression. The aim of this study was to examine, if PLHV-1 ORF50, ORFA6/BZLF1h and ORF57 are transcriptional activators, regulating the switch from latent to lytic viral replication. First, the activation of different PLHV-1 promoters was tested. PLHV-1 ORF50 strongly activated the promoters of orfA6/BZLF1h, orf57, orf59, DNA-polymerase and glycoprotein B in 293- Graham and PK15 cells. ORF50 also weakly stimulated its own expression. In comparison to ORF50, ORFA6/BZLF1h activated the promoters to a lesser extent. In contrast, PLHV-1 ORF57 did not stimulate promoter activity. Coexpression of ORF50 and ORFA6/BZLF1h resulted in a dose-dependent repression of the ORF50-mediated transactivation of orfA6/BZLF1h, orf57 and orf59 in 239-Graham cells. In contrast, ORFA6/BZLF1h enhanced the ORF50-mediated transactivation of the orf50 promoter. The suppressive effect of ORFA6/BZLF1h on ORF50 was not seen in PK15 cells. ORFA6/BZLF1h and ORF50 synergistically activated the promoters of orfA6/BZLF1h, orf50, orf57 and orf59. ORFA6/BZLF1h influenced the transcriptional activity of ORF50 in a promoter and cell specific manner. A direct interaction between ORF50 and ORFA6/BZLF1h in immunoprecipitates could not be shown. When ORF50 was coexpressed with ORF57 theGraham cells. This synergistic effect was also seen in PK15 cells. A direct association between ORF50 and ORF57 could not be shown. To investigate possible interactions between PLHV-1 and EBV at the molecular level, the transactivation of (1) PLHV-1 promoters by EBV BZLF1, BRLF1 or (2) EBV promoters by PLHV-1 ORF50 and ORFA6/BZLF1h were examined. EBV BRLF1 strongly transactivated the PLHV-1 promoters of orf50, orf57 and orf59 in 293-Graham cells. EBV BZLF1 stimulated PLHV-1 promoter activity to a lesser extent. In contrast, PLHV-1 ORF50 did not transactivate EBV promoters. PLHV-1 ORFA6/BZLF1h showed a weak transcriptional activity on EBV promoters. In cell culture, overexpression of PLHV-1 ORF50 and/or ORFA6/BZLF1h in latently with PLHV-3 infected cells did not induce lytic viral replication. Expression of EBV BZLF1 and/or BRLF1 in these cells also did not lead to PLHV-3 reactivation. Transfection of the PLHV-1 ORF50 expression plasmid into EBV-positive cells induced a 2-fold accumulation of EBV copies in the cell. When EBV BZLF1 was overexpressed in EBV-positive cells, a 5-fold accumulation of EBV copies was measured, indicating that lytic viral replication was induced. The strongest effect (14-fold) on EBV reactivation was observed with TPA. When PLHV-3- positive cells were co-cultured with EBV-positive cells, neither a reactivation of EBV nor a reactivation of PLHV-3 was observed. These results include important facts for virus safety in xenotransplantation. ORF50 of PLHV-1 is probably the main transactivator for the switch from latent to lytic PLHV replication. The molecular interactions between PLHV-1 and human herpesviruses could be an indication for reciprocal reactivation in xenotransplantation. Therefore, PLHV-1 is a potential risk for organ recipients. For the use as donors in xenotransplantation, breeding of PLHV-free pigs is recommended.