Etablierung eines siRNA-basierten Systems zur Untersuchung pockenviraler host-range-Effekte

Abstract

In den letzten Jahren wurden weltweit vermehrt humane Infektionen mit Orthopockenviren (OPV) beobachtet. Hierbei handelte es sich in allen Fällen um Zoonosen, bei denen tierpathogene OPV beim Menschen Erkrankungen hervorriefen. Die molekularen Mechanismen, die für einen solchen Spezieswechsel der OPV verantwortlich sind, sind bisher weitgehend unverstanden. Für die orthopockenviralen Gene C7L, K1L und CP77 wurde ein Einfluss auf den sogenannten host-range der OPV beschrieben. Ziel dieser Arbeit war es, unter Verwendung der Methode der RNA-Interferenz ein in vitro Modell zur Untersuchung von host-range-Effekten durch einen knockdown dieser Gene zu generieren. Die Zelllinien HEK293T, RK13 und CHO-K1 wurden hierfür mit short hairpin RNAexprimierenden Plasmiden transfiziert, wobei die short hairpin RNAs intrazellulär zu aktiven small interfering RNAs (siRNAs) prozessiert werden. Nach Infektion der transfizierten Zellen mit Kamelpockenvirus (CMLV) CP-19, Vacciniavirus (VACV) Western Reserve und Kuhpockenvirus (CPXV) Brighton Red erfolgte die Untersuchung des knockdowns der host-range-Gene auf RNA-Ebene mittels Reverser Transkriptase Real-Time-PCR. Der indirekte Immunfluoreszenzassay (IFA), Plaque-Titrationstest und Impedanzmessung wurden eingesetzt, um eine siRNA-vermittelte Inhibition der Virusreplikation nachzuweisen. In HEK293T-Zellen konnte durch Einsatz von siRNAs eine relative C7LGenexpression von 20 % ± 10 % erzielt werden. In RK13-Zellen wurde die K1LGenexpression auf 20 % reduziert. Die siRNA-vermittelte Inhibition der Replikation von CMLV CP-19 und VACV WR konnte mittels IFA, im Plaque-Titrationstest und in der Impedanzanalyse nachgewiesen werden. Die Genexpression von CP77 in CHO-K1- Zellen wurde durch Einsatz von siRNAs auf 13 % ± 2 % reduziert. Die Effekte der siRNA auf die Replikation des CPXV BR konnten nicht vollständig geklärt werden. Die etablierten siRNA-basierten Systeme wurden weiterhin auf ihre Validität in Kamelund Nagetierzellen untersucht. Die Transfektionsbedingungen wurden optimiert und eine permissive Infektion der drei Virusstämme in beiden Zelllinien nachgewiesen. Die etablierten siRNA-basierten Systeme bieten eine effiziente Alternative zur Erzeugung von Deletionsmutanten und können in weiterführenden Transkriptom- und Proteomanalysen einen Beitrag zur Aufklärung von molekularen Mechanismen des Wirtstropismus der Pockenviren liefern.

During the last years, there has been an increasing number of zoonotic infections in humans caused by Orthopoxviruses (OPV). Until today, the molecular mechanisms that enable OPV to overcome species barriers are still not completely understood. The orthopoxviral genes C7L, K1L and CP77 are known to play an important role in the mediation of OPV host range. The aim of this project was to generate an in vitro model for the investigation of host range effects by introducing a knockdown of these host range genes using RNA interference. The eukaryotic cell lines HEK293T, RK13 and CHO-K1 were transfected with short hairpin RNA-expressing vectors, being processed to active siRNAs via intracellular mechanisms. The cells were infected with Camelpoxvirus (CMLV) CP-19, Vacciniavirus (VACV) Western Reserve and Cowpoxvirus (CPXV) Brighton Red. Reverse transcriptase real-time PCR was used to investigate the knockdown at RNA level. Indirect immunofluorescence assay (IFA), plaque assay and impedance measurement were applied for detection of siRNAmediated inhibition of poxviral replication. In HEK293T cells, a relative gene expression of C7L of 20 % ± 10 % was achieved. The relative gene expression of K1L in RK13 cells was reduced to 20 %. siRNAmediated inhibition of CMLV CP-19 and VACV WR replication was shown via IFA, plaque titration assay and impedance measurement. The relative gene expression of CP77 in CHO-K1 cells was reduced to 13 % ± 2 %. The effect of the used siRNA on CPXV BR replication could not be entirely elucidated. The established siRNA-based systems were additionally analysed on a camel and a rodent cell line. Transfection conditions were optimised and viral replication of the three poxvirus strains CMLV CP-19, VACV WR and CPXV BR was shown to be permissive in both cell lines. The established siRNA-based systems are an efficient alternative to the generation of deletion mutants and can be analysed in subsequent transcriptome and proteome analysis. This is useful for further investigation of the molecular mechanisms determining poxvirus host tropism.