Charakterisierung von Bakteriophagen aus Burkholderia spp. und Yersinia spp. und der Phagen-kodierten Lysine

Abstract

Burkholderia pseudomallei und Burkholderia mallei sind die Erreger der Melioidose bzw. Rotz, Yersinia pestis verursacht die Pest. Die drei bioterroristisch relevanten Bakterien zählen zu den potentiellen biologischen Kampfstoffen. Die teils problematische Differenzierung von Bakterien der gleichen Gattung und das zunehmende Auftreten multiresistenter Bakterienstämme, welche die Behandlung mit herkömmlichen Antibiotika erschwert, erfordert daher einerseits Möglichkeiten zur spezifischen Diagnostik solcher Erreger und andererseits neue Therapiemethoden. Bakteriophagen sind hochspezifische Viren, die suszeptible Wirtsbakterien mittels zellwandabbauender Enzyme, sogenannter Bakteriophagen-Endolysine, lysieren. Somit können Phagen bzw. Phagenlysine sowohl für die spezifische Diagnostik als auch zur Therapie eingesetzt werden. Die spezifische Detektion von B. mallei ist mit temperenten Burkholderia- Phagen bereits möglich. Daher sollten Phagen aus der Gattung Burkholderia isoliert und charakterisiert werden, die eine spezifische Diagnostik von B. pseudomallei ermöglichen. Da bisher keine Lysine bekannt sind, die Gram-negative Bakterien bei exogener Anwendung lysieren können, war es zusätzlich von großem Interesse, das Phagenlysin eines neuen Burkholderia-Phagen und des lytischen Yersinia-Phagen PY100 zu identifizieren und deren Potential zur Abtötung dieser Erreger zu untersuchen. Vier verschiedene temperente Phagen konnten aus Burkholderia-Stämmen isoliert werden, die anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen in die Familie der Myoviridae in die Ordnung der Caudovirales eingruppiert werden können. Zwei Phagen, der Phage phiE067 aus Burkholderia thailandensis und der Phage phiBp10 aus B. pseudomallei, können aufgrund ihrer Wirtsspektren in Kombination miteinander für die Diagnostik zur Differenzierung der Burkholderia Spezies B. thailandensis, B. pseudomallei und B. mallei eingesetzt werden. Durch Hybridierungsversuche wurden die phylogenetischen Verwandtschaften der Phagen miteinander und im Vergleich zum publizierten Phagen phi1026b bestimmt. Das Genom des Phagen phiE067 wurde sequenziert, um eine molekulargenetische Charakterisierung des Phagens vorzunehmen. Das doppelsträngie DNA-Molekül hat eine Größe von 43,649 kb. Die 69 identifizierten potentiellen offenen Leserahmen (ORFs) sind in vier verschiedenen Operons angeordnet, was einer lambdoiden Genomorganisation entspricht. Bei 19 ORFs war durch eine bioinformatische Analyse oder den direkten experimentellen Nachweis eine Funktionszuordnung möglich. Diese beinhalten Proteine der DNAVerpackung, strukturelle Komponenten, das duale Lysis-System und Proteine, die an Replikation, Rekombination und Modifikation der Phagen DNA beteiligt sind. Die meisten Homologien auf Aminosäuresequenzebene konnten im Bereich der Strukturproteine zu Phagen des Burkholderia cepacia Komplexes festgestellt werden, die ebenfalls zur Familie der Myoviridae gehören. In den Genomen des Burkholderia-Phagen phiE067 und Yersinia-Phagen PY100 konnten die Gene, welche für die Phagenlysine PlyE067 und Ply100 kodieren, identizifiziert und in E. coli kloniert werden. Durch eine terminale Fusion der Proteine mit einem Hexa-Histidin-Tag, konnte die Aufreinigung der Proteine mittels Affinitätschromatographie vorgenommen werden. Nach bioinformatischen Analysen wurde bei PlyE067 eine N-Acetyl-β-DMuramidase Domäne und bei Ply100 eine D-Alanyl-D-Alanin Carboxylpeptidase Domäne identifiziert. Die lytische Aktivität von PlyE067 als auch Ply100 konnte mit Hilfe von Sphäroblasten Gram-negativer Bakterien experimentell nachgewiesen werden. Unbehandelte Gram-negative Erreger wurden durch beide Enzyme nicht lysiert, da die äußere Membran eine nicht zu überwindende Barriere für die Endolysine darstellt. Somit wurde bestätigt, dass Phagenlysine ohne zusätzliche Agenzien zur Eliminierung Gram-negativer Erreger nicht geeignet sind. Es wurden für beide Lysine die optimalen enzymatischen Bedingungen bestimmt, wobei die extreme Hitzestabilität von Ply100 hervorzuheben ist. Selbst nach einer 120 minütigen Behandlung bei 99°C behielt das Enzym seine hydrolytische Aktivität. Diese hohe Hitzestabilität könnte potentiell sehr nützlich sein bei dem möglichen Einsatz des Lysins zu Dekontaminationszwecken in der Lebensmittelindustrie.

Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei are the causative agents of melioidosis and glanders. Yersinia pestis causes plague. Therefore, these biological threat agents are considered as potential biological warfare agents. It is often difficult to distinguish between bacterial species of one genus. Furthermore, the increasing number of multiresistant bacterial strains does not respond to conventional antibiotics. Thus, on the one hand, it is essential to develop specific diagnostic assays to discriminate between these microorganisms, on the other hand, new therapeutical techniques are needed. Bacteriophages are highly specific viruses that lyse susceptible bacterial hosts by means of lytic enzymes (bacteriophage-endolysins) digesting the bacterial cell wall. Therefore, phages or phage lysins can be used for diagnostics as well as for therapeutics. B. mallei for instance may be detected by temperate phages phiE125 and phi1026b. One aim was to isolate and characterise phages from Burkholderia to find a useful diagnostic tool for B. pseudomallei. Since no lysins are known to be able to hydrolyse cell walls of Gram-negative cells when added externally, it was also of great interest to detect the endolysin of a new Burkholderia phage and of the lytic Yersinia phage PY100. The Endolysins were examined for their potential to eliminate these pathogens. Within the framework of this study, four different phages from Burkholderia strains were isolated. Examination of the bacteriophages by electron microscopy revealed that they can be classified as members of the family of Myoviridae of the order Caudovirales. Phage phiE067 deriving from Burkholderia thailandensis and phiBp10 deriving from B. pseudomallei can be used in combination to differentiate B. thailandensis, B. pseudomallei and B. mallei. Based on DNA-hybridizations, a phylogenetic relation was determined between the isolated phages and the B. mallei specific phage phi1026b. PhiE067 was chosen for detailed analysis at molecular level with its genome being sequenced. It consists of a double stranded DNA molecule of 43,649 kb. The 69 identified open reading frames (ORFs) are organized in 4 major operons which correspond with lambdoid phages. Functions could be assigned to 19 gene products, based upon bioinformatic analyses or direct experimental evidence. These include DNA packaging proteins, structural components, the dual lysis system and proteins that are involved in replication, recombination and modification of phage DNA. Most amino acid sequence homologies were identified in structural proteins of Myoviridae phages of the Burkholderia cepacia complex.The endolysin genes plyE067 and ply100 were identified in the genome of the Burkholderiaphage phiE067 as well as the Yersinia phage PY100 and cloned in Escherichia coli. Aminoterminal modification by a hexahistidine tag enabled purification by affinity chromatography. Bioinformatics showed PlyE067 featuring an N-Acetyl-β-D-Muramidase domain and Ply100 featuring a D-Alanyl-D-Alanin Carboxylpeptidase domain. The lytic activity of PlyE067 and Ply100 was demonstrated experimentally by sphaeroplasts of Gram-negative cells. Untreated Gram-negative cells were resistant to the endolysins due to the fact that the outer membrane represents an efficient barrier for prevention of lysis by free endolysin. These results affirmed the current state of research that, without additional agents, lysins do not work with Gramnegative bacteria. For both endolysins optimal enzymatic conditions could be determined while Ply100 turned out to be extremely thermostable. Even after a treatment of 99°C for 120 minutes the enzyme maintained its hydrolytic activity. This characteristic thermostability could be useful for the food conservation technology.