Foamy virus Bet fusion proteins for induction of neutralising antibodies against HIV-1

Abstract

Seit der Entdeckung des HI Virus in den frühen 1980iger Jahren, spiegelt die von ihm ausgelöste AIDS Pandemie mit mehr als 30 Millionen Toten weltweit eine der ernstzunehmensten Krankheiten unserer Zeit wieder. Trotz intensiver Forschung und der stetig wachsenden Kenntnis der HIV Biologie ist jedoch bisher noch kein sicherer und präventiver HIV Impfstoff verfügbar. Die hohe Diverstät von HIV kompliziert dabei die Herstellung eines universellen Impfstoffes gegen verschiedene Subtypen. Ein Ansatz konzentriert sich daher auf die Induktion breitneutralisierender Antikörper gegen stark konservierte Bereiche des Virus. Zwei dieser breitneutralisierenden Antikörper, 2F5 und 4E10, erkennen Epitope in der membran-proximalen externen Region (MPER) des viralen transmembranen Hüllproteins gp41 und gehören mit einer Neutralisationsbreite von 95% gegen hochprevalente HIV Stämme zu den potentesten breitneutralisierenden Antikörpern. Die Induktion solcher Antikörper durch klassische Vakzinierungsstrategien blieb jedoch bislang erfolglos. Als mögliche Gründe werden die hohe strukturelle Flexibilität des Zielepitops, dessen geringe Immunogenität sowie Immuntoleranzmechanismen diskutiert. Diese Masterarbeit war Teil eines Projekts in dem mit Hilfe replikations-kompetenter Foamyviren eine neue Strategie der Antigenüberlieferung verfolgt wird. Durch eine kontinuierliche Antigenpräsentation soll hierbei die Immunogenität der HIV Epitope erhöht und so die Induktion neutralisierender 2F5 und 4E10 ähnlicher Antikörper ermöglicht werden. Im Gegensatz zu bisherigen Strategien sollten die 2F5 und 4E10 Epitope hierbei durch eine am N-terminus lokalisierte gp41 Domäne stabilisiert werden, die in vorhergehenden Versuchen eine verstärkte Bindung von 2F5 an sein Epitop bewirkte. Für die Überlieferung der HIV Domänen wurde in dieser Arbeit das akzessorische Bet Protein des Foamyvirus verwendet, welches im hohen Maße von infizierten Zellen exprimiert und sekretiert wird und somit ein ideales Trägerprotein darstellt. Es wurden fünf rekombinante Bet/HIV-1 Hybridantigene kloniert, expremiert und aufgereinigt und anschließend auf ihre Antigenität hin untersucht. In Immunisierungsstudien wurde weiterhin getestet, ob HIV spezifische Antikörper induziert werden können und ob diese Antikörper womöglich bereits ohne die Präsentation durch das Foamyvirus neutralisierend auf HIV wirken. Die Untersuchungen ergaben, dass alle Antigene, die die 2F5 und 4E10 Epitope enthielten, sowohl unter denaturierenden als auch unter physiologischen Bedingungen von den HIV-neutralisierenden Antikörpern erkannt und ein Konstrukt mit stabilisierender zweiter Domäne stärker gebunden wurde. Die Immunisierungsstudien zeigten eine hohe Immunogenität der vollständigen Bet-Fusionsproteine belegt durch die Induktion hoher Antikörpertiter. Auch die fusionierten HIV-Domänen wurden vom Immunsystem erkannt und gp41-spezifische sowie 2F5- und 4E10-Epitop-spezifische Antikörper gebildet. Diese Antikörper erkannten zwar ihre natürlichen Epitope, jedoch wiesen sie noch keine Neutralisierungsaktivität in einem Indikatorzelllinien basierten Neutralisations- Assay auf. Zusammengefasst zeigt diese Masterarbeit die Eignung des Bet Proteins als hoch immunogenen Fusionspartner für die Präsentation von HIV-Domänen. Aufgrund der vorliegenden Daten kann die hier vorgestellte Strategie weiter verfolgt und die Präsentation der Antigene mit Hilfe von replikations-kompetenten Foamyviren getestet werden.

AIDS is with more than 33 million deaths worldwide one of the most serious diseases of our time. Despite intensive research, 30 years after HIV discovery no preventive vaccine is available. In regard to vaccine development, the broadly neutralising antibodies 2F5 and 4E10 have since been from particular interest. These antibodies target epitopes in the membrane proximal region of the transmembrane envelope protein gp41 of HIV-1 and are able to neutralise up to 95% of all major HIV-1 strains. However, although these antibodies were isolated from naturally infected individuals, all attempts to induce such antibodies by vaccination failed so far. As reasons, the conformational variability of the target epitope, its low immunogenicity as well as immune tolerance mechanisms are discussed. This thesis was embedded in a project that aims to deliver the 2F5 and 4E10 epitopes by a novel approach using replication competent foamy viruses to increase antigen immunogenicity. In contrast to other strategies, the 2F5 and 4E10 epitopes should hereby be stabilised by a second domain derived from the opposite N-terminal part of gp41 which has been shown to result in increased epitope binding of 2F5. The HIV domain shall fused with the accessory Bet protein of foamy viruses which is highly expressed in infected cells and secreted to the environment representing an ideal carrier protein for immune stimulation. The aim of this thesis was to investigate whether such Bet fusion proteins with HIV-1 inserts are accessible for monoclonal antibodies 2F5 and 4E10, whether they are immunogenic when used in immunisation studies and, whether HIV specific neutralising antibodies can be induced. For this, recombinant Bet and Bet/HIV proteins were produced in E. coli and based on refolding protocols purified to homogeneity. All proteins containing the 2F5 and 4E10 epitopes were recognised by these antibodies under denaturing as well as under physiological conditions. By immunisation of rats with these proteins it was found that the Bet carrier protein is a highly immunogenic fusion partner inducing high levels of antibodies in all rats. Importantly, also the fused HIV domains were recognised by the immune system and gp41 as well as 2F5 and 4E10 epitope specific antibodies generated. However, despite the fact that these antibodies targeted the HIV epitopes, they were not able to prevent HIV infection in an indicator cell line based neutralisation assay. In summary, this work demonstrates the suitability of Bet as highly immunogenic fusion partner for antigen delivery and provides promising data for testing the transfer of these Bet/HIV hybrid domains into replication competent vectors.