Expression rekombinanter, von HIV-1 gp41 abgeleiteter Proteine für die Analyse der Immunpathogenese

Abstract

Zur Etablierung eines Endotoxin-freien Bacillus megaterium Produktionssystems wurden zehn mittels PCR amplifizierte, von HIV-1 g41 abgeleitete Fragmente hergestellt und in transformations-kompetente B. megaterium Protoplasten eingebracht. Durch Optimierung bestehender Standardprotokolle zur Herstellung von Protoplasten war es möglich Transformationseffizienzen von etwa 102 cfu pro μg DNA zu erreichen und somit von der kostenintensiven Verwendung kommerziell erhältlicher B. megaterium Protoplasten abzusehen. Von insgesamt über 500 getesteten Klonen konnten ca. 200 mittels colony-PCR für positiv befunden werden. Allerdings wurden lediglich drei Klone identifiziert, die auch in der Lage zur heterologen Expression der Fremdproteine waren. Erreichte Expressionslevel waren extrem niedrig und konnten selbst nach aufwendigen Anstrengungen zur Optimierung und Bestimmung optimaler Expressionsbedingungen nicht signifikant gesteigert werden. Nach Aufreinigung von StrepII-ΔNHR 4K-His aus der intrazellulären Proteinfraktion (Zellpellet) konnten letztendlich Proteinmengen von rechnerisch ca. 80 μg ermittelt werden, wobei es nicht möglich war, StrepII-ΔNHR 4K-His in reiner Form zu gewinnen. Entgegen allen Erwartungen führte die Codon-Optimierung von ΔNHR 4K entsprechend der codon usage bias von B. megaterium MS941 zu einer verminderten Proteinproduktion, was auf mögliche Sekundärstrukturen der resultierenden messenger-RNA zurück zu führen ist. Aufgrund der im Vergleich zu E. coli ausgesprochen niedrigen Transformationseffizienz, sowie dem äußerst schlechten Vermögen zur Produktion der HIV-1 gp41 Verkürzungsmutanten, konnte B. megaterium für diese Zwecke nicht als geeigneter Produktionsorganismus genutzt werden. Im Gegensatz hierzu war es möglich, das transmembrane Hüllprotein gp36 des humanen endogenen Retrovirus K (HERV-K) in der methylotrophen Hefe Hansenula polymorpha RB11 überzuexprimieren und eine Gesamtmenge von etwa 540 μg aus 1 L Expressionskultur aufzureinigen. Zum Aufschluss der äußerst robusten Hefezellwände erwies sich der Einsatz von Zymolyase in Kombination mit dem mechanischen Aufschluss durch Glaskugeln als äußerst effektiv. Untersuchungen bezüglich der immunsuppressiven Eigenschaften von HERV-K TM auf humane PBMCs zeigten eine konzentrationsabhängige Steigerung der IL-10 Sekretion nach 24-stündiger Inkubation, welches als Marker für eine immunsuppressive Wirkung angesehen werden kann. Da dieses Ergebnis bereits in Vorarbeiten der Arbeitsgruppe gezeigt werden konnte, kann H. polymorpha somit als geeigneter Wirt für die Endotoxin-freie Produktion von HERV-K TM bestätigt werden und bietet sich ebenfalls für die Produktion der gp41 Verkürzungsmutanten an.