Analyse der Interaktion der N-terminalen Domäne des transmembranen Hüllproteins gp41 mit zellulären Proteinen

Abstract

Momentan leben weltweit 33,2 Millionen Menschen mit HIV/AIDS (UNAIDS/WHO, 2007), welche durch eine bislang nicht reversible, tödlich verlaufende Störung der Immunabwehr gekennzeichnet ist. Um effektivere therapeutische und prophylaktische Strategie bieten zu können, muss ein besseres Verständnis für die Pathogenese einer HIV-Infektion geschaffen werden. Bisher ist noch völlig unklar, wie durch eine Infektion mit HIV eine Immunsuppression ausgelöst wird. Es wird davon ausgegangen, dass bei der Fusion von Virus- und Wirtszellmembran durch die Interaktion der gp41 Ektodomäne mit einem noch unbekannten Rezeptor immunsuppressive Prozesse ausgelöst werden. Im Rahmen der vorliegenden Diplomarbeit sollten neue putative Interaktionspartner der gp41 Ektodomäne identifiziert werden. Hierbei erfolgte zunächst ein yeast two-hybrid screening mit einem Deletionskonstrukt (ΔNHR) der gp41 Ektodomäne in einer humanen Leukozytengenbank. Anschließend konnten mit Hilfe einer weiteren yeast two-hybrid Analyse, der Nutzung von Selektivmedien, dem X-α-Gal Test und anschließender Sequenzierung, mehrere putative Interaktionspartner identifiziert werden. Als ein möglicher Bindungspartner in diesem System konnte der triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1) identifiziert werden. Die Verifizierung der putativen Interaktion sollte anschließend mittels GST-pull down erfolgen. Hierbei wurden zunächst zur Eingrenzung des Interaktionsbereiches mittels Klonierung mehrere gp41 Deletionsmutanten hergestellt und anschließend die optimalen Induktionsbedingungen für eine Expression der GST-Fusionsproteine in Bakterien ermittelt. Durch Zytosol-Membran-Fraktionierung und mehrfach erfolgte transiente Transfektion konnten jedoch keine Zelllysate hergestellt werden, in denen TREM-1 angereichert vorliegt, sodass in den folgenden pull down Analysen ein freundlicherweise zur Verfügung gestelltes rekombinantes lösliches TREM-1 zum Einsatz kam. Die Interaktion zwischen der ISU-Domäne der gp41 Ektodomäne und TREM-1 konnte aufgrund eine starken unspezifischen Bindung mittels pull down nicht weiter verifiziert werden. Im Anschluss an diese Arbeit sind daher weitere Optimierungen des pull down assays nötig, um eine Interaktion verifizieren zu können. Ferner müssen noch weitere Methoden genutzt werden, um eine Interaktion zwischen der ISU-Domäne der gp41 Ektodomäne und TREM-1 bestätigen zu können.