PERV und Xenotransplantation: Impfstoffe, RNAi und genotypische Selektion

Abstract

Die porzinen endogenen Retroviren (PERVs) stellen für die Xenotransplantation derzeit ein schwer einzuschätzendes Risiko dar. Sie besitzen die Fähigkeit, in vitro humane Zelllinien zu infizieren und sich an diese zu adaptieren. Jedoch konnte in ersten klinischen Xenotransplantationen sowie in verschiedenen Tiermodellen bislang keine Übertragung von PERVs festgestellt werden. Ihr pathogenes Potential ist weitestgehend unbekannt. Auf Grund ihrer phylogenetischen Verwandtschaft zu pathogenen Retroviren sind Tumore, neurologische Erkrankungen und Immunschwächen zu erwarten. Um eine Übertragung zu verhindern, wurden verschiedene Strategien zur Minimierung des Risikopotentials entwickelt.In der vorliegenden Arbeit wurde im ersten Teil die Eignung der viralen Hüllproteine gp70 und p15E als Impfstoff zur Induktion neutralisierender Antikörper gezeigt. Mit den rekombinanten Proteinen konnten in fünf verschiedenen Spezies antigenspezifische Antikörper induziert werden. Durch Epitopkartierungen wurde belegt, dass die immundominanten Bereiche der induzierten p15E-Antikörper in der MPER und der FPPR lokalisiert sind und Ähnlichkeiten zu Epitopen HIV-1-neutralisierender Antikörper aufweisen. In einem Neutralisationsassay auf Basis der Bestimmung der Provirusintegration mittels qRT-PCR konnten die PERV-neutralisierenden Eigenschaften von anti-p15E und anti-gp70 Seren charakterisiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Inhibition der PERV-Expression in vivo und in vitro mittels RNA Interferenz untersucht. Es wurden transgene Schweine mit PERV-spezifischer shRNA (pol2) generiert und über einen Zeitraum von zwei Jahren beobachtet. Trotz des Nachweises der shRNA Expression durch ein neues qRT-PCR basierendes System konnten in PBMCs und Fibroblastenkulturen der Tiere keine Reduktion der PERV-Expression im Vergleich zu den Kontrolltieren nachgewiesen werden. Neue in vitro Daten sowie eine vergleichbare Studie belegen jedoch die grundsätzliche Funktionalität der Methodik. Eine neue effektive shRNA-Sequenz wurde identifiziert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden verschiedene PCR basierte Techniken zur Identifizierung PERV-C-freier Tiere charakterisiert. Zwar ist PERV-C nicht humantrop, doch geht von rekombinanten PERV-Stämmen aus den Subtypen A und C eine besondere Gefahr aus. Da PERV-C im Gegensatz zu PERV-A und PERV-B nicht in allen Schweinen vorkommt, sollten gemäß einer Konsensus-Veröffentlichung der International Xenontransplantation Association (IXA) für zukünftige Xenotransplantationen ausschließlich PERV-C-freie Tiere verwendet werden. In der vorliegenden Arbeit wurden transgene und nicht-transgene Hausschweine auf PERV-C-Proviren getestet und 35 von 38 Tieren als positiv identifiziert. In einem Infektionsversuch wurden drei negativ getestete Hausschweine mit einem hochtitrigen rekombinanten PERV-A/C-Stamm inokuliert, wobei keine Replikation über einen Zeitraum von vier Monaten nachgewiesen werden konnte. Bei der Analyse von 125 Wildschweinen wurde durch Anpassung alter und durch Entwicklung neuer PCR-Setups ein neues bisher unbeschriebenes PERV-C-Provirus entdeckt, das phylogenetische Verwandtschaft zu einem im Bartschwein (Sus barbatus) gefundenen Provirus zeigt. Interessanterweise wurden in keinem der Wildschweine enge Verwandte des hausschweintypischen PERV-C gefunden.