Etablierung von Testsystemen zur Charakterisierung der Apoptose-Induktion in Mumpsvirus-infizierten Zellen

Abstract

Das Mumpsvirus, welches zur Familie der Paramyxoviren gehört, kodiert für ein kleines hydrophobes Protein (SH-Protein), welchem antiapoptotische Eigenschaften zugeschrieben werden (Wilson et al., 2006). In Zellkulturüberständen einer Infektion mit einer SH-defizienten Rekombinante vom Parainfluenzavirus 5, welcher zur gleichen Familie wie das Mumpsvirus gehört, konnte eine erhöhte Konzentration des Zytokins Tumornekrosefaktor α (TNFα), welches zu den Hauptauslösern des programmierten Zelltods zählt, festgestellt werden. Auch eine verstärkte Aktivierung von NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells), einem Transkriptionsfaktor für TNFα, konnte bereits detektiert werden (Lin et al., 2003). Somit liegt die Vermutung nahe, dass das SH-Protein den TNFα-induzierten Apoptoseweg inhibiert und somit die Induktion der Apoptose der infizierten Zellen hinauszögert, was dem Mumpsvirus einen längeren Zeitraum für die Replikation verschafft (Wilson et al., 2006). Die Induktion des programmierten Zelltodes durch TNFα wurde bereits mittels plasmid-exprimiertem SH-Proteins in HEK293-Zellen untersucht. In diesem transienten System konnte jedoch keine antiapoptotische Wirkung des SH-Proteins detektiert werden, was vermutlicher Weise darauf zurückzuführen ist, dass virale Faktoren eine essentielle Rolle spielen und deshalb wurden die folgenden Versuche in der vorliegenden Arbeit im Viruskontext durchgeführt (Wiegand, 2010). Als erstes konnte eine geeignete Positivkontrolle für die Induktion von Apoptose in Vero-Zellen mittels Stimulation mit Cycloheximid (CHX) und TNFa etabliert werden. Unter Verwendung dieser Kontrolle war es möglich das TUNEL-Assay und den Apoptose-Nachweis mittels M30-Antikörper als Analysemethoden hierfür auszuschließen. Es konnte jedoch auch ein geeignetes Nachweissystems für die Induktion der Apoptose in Mumpsvirus-infizierten Vero-Zellen etabliert werden, wobei es sich hier um den Nachweis des DNA-Reparaturenzyms Poly(ADP-ribose)-Polymerase und dessen Spaltprodukt mittels spezifischen Antikörpern im Western Blot handelt (Li et al., 2000). Somit konnten einerseits ein Impfstamm mit einem Wildtypstamm von Mumps und andererseits eine SH-defiziente Rekombinante mit einer Rekombinante mit intaktem SH-Protein bzgl. der Apoptose-Induktion während des Infektionsverlaufs vergleichend untersucht werden. Dadurch war es möglich die antiapoptotischen Eigenschaften des SH-Proteins während einer Mumpsvirus-Infektion zu belegen und zur Aufklärung bzw. Charakterisierung der Proteinfunktion beizutragen.