Vollständige Genomanalyse einer neuen rekombinanten Form von HIV-1 aus Oman

Abstract

Die globale HIV-1 Epidemie ist durch die unterschiedliche geographische Verteilung verschiedener HIV-1 Subtypen (A-D, F-H, J, K) und derzeit 72 zirkulierender rekombinanter Formen (CRF) charakterisiert. Um eine neue CRF zu definieren, muss diese in mindestens drei epidemisch nicht verknüpften Infektionen identifiziert werden; zwei Komplettgenom-sequenzen sowie eine dritte partielle Genomsequenz, mit der die Rekombinationsstruktur bestätigt werden kann, müssen für die Klassifikation einer CRF vorliegen. Bei omanischen HIV-1 infizierten Patienten mit Therapieversagen wurden im Rahmen der Resistenz-bestimmung singuläre rekombinante pol-Sequenzen (URFs) identifiziert, die eine eigene monophyletische Gruppe in der Stammbaumanalyse bildeten und zunächst als „URF-new clade“ benannt wurden. Ziel der vorliegenden Arbeit war, das vollständige Genom von mindestens zwei inklusive eines partiellen Genoms der putativ neuen Virusvarianten zu analysieren und die phylogenetische Sequenzanalyse dieser HIV-Varianten durchzuführen, um damit eine Klassifikation als neue CRF zu ermöglichen. Das Komplettgenom der putativ neuen HIV-Variante wurde in einer „vier-Amplikon-PCR“ mit vier überlappenden Fragmenten amplifiziert und sequenziert (Sanger). In dieser Arbeit konnte von einem Isolat mit bereits bekannter 5‘-Genomsequenz die 3‘-Genomsequenz zur Komplettgenomsequenz vervollständigt werden. Zusätzlich konnten von zwei weiteren Isolaten alle vier Fragmente amplifiziert werden. Von diesen wurde eine weitere Komplett-genomsequenz und eine partielle Genomsequenz bestimmt. Die Komplettgenomsequenzen bildeten in der Neighbor Joining Stammbaumanalyse wiederum eine eigenständige mono-phyletische Gruppe. Die relativ hohe paarweise genetische Distanz (> 2,5 %) der viralen Sequenzen bestätigte die epidemiologische Unabhängigkeit der Infektionen. Die Analysen der Genomstruktur zeigen für alle drei Isolate eine sehr ähnliche Rekombinationsstruktur, die sich überwiegend aus Subtyp G und geringen Anteilen an Subtyp D zusammensetzt (pol- und vif-Region). Die Ergebnisse der Stammbaumanalyse und der Analyse der Rekombinationsstruktur dieser neu identifizierten omanischen Isolate lassen den Schluss zu, dass es sich bei diesen Viren um eine neue CRF handelt. Die Kriterien zu ihrer Definition sind mit Abschluss dieser Masterarbeit erfüllt. Die offizielle Klassifizierung durch HIV Taxonomie-Experten ist aktuell in Bearbeitung.

The global HIV-1 epidemic is characterized by the different geographic spread of diverse HIV-1 subtypes (A-D, F-H, J, K) and currently 72 circulating recombinant forms (CRF). To define a new CRF the same virus variant needs to be identified in at least three epidemically unlinked infections; two full-length genome sequences and a third partial genome sequence which confirms the recombination structure of the two full-length genomes have to be presented to classify a CRF. In Omani patients with treatment failure unique recombinant forms (URFs) of pol-sequences were identified during resistance testing. These sequences were localized in a distinct clade of the phylogenetic tree (neighbor joining method) and were first named URF-new clade. The aim of this study was the analysis of at least two full-length HIV genomes including one partial genome and phylogenetic sequence analysis of the new clade strains to finally enable their future classification as new CRF. The full-length genome of the putative new HIV variant was amplified with a "four-amplicon-PCR" with four overlapping PCR fragments and sequenced (Sanger method). During this thesis the 3’-genome sequence of a viral isolate of which the 5’-genome was already analyzed was determined and a full-length sequence was produced. In addition, all four PCR fragments could be amplified from two other candidate isolates. Of those, one full-length sequence and one partial genome sequence was determined. In the neighbor joining phylogenetic tree the full-length sequences co-localized in a distinct clade confirming the results obtained with the pol-subsequences. The relatively high pairwise genetic distance (> 2,5 %) of the viral sequences confirmed that unlinked HIV infections were identified. Analyses of the recombinant genome structure of all three isolates revealed a very similar pattern of recombination mainly composed of subtype G combined with small parts of subtype D (pol and vif region). The results of the phylogenetic analysis and the analysis of the pattern of recombination of these isolates support the view that the newly identified Omani HIV isolates represent indeed a new CRF. The criteria to define a new CRF are full-filled by finalizing this Master thesis. The official classification by HIV taxonomy experts is currently in progress.