Modulation der Expression des Rec-Proteins von HERV-K(HML-2) in primären Zellen

Abstract

Häufig kommt es in Tumorgeweben zu einer erhöhten Transkript- und Proteinexpression bis hin zu unreifen Partikeln der humanen endogenen Retrovirus und besonders der HERV-K(HML-2)-Familie. Das retrovirale RNA-Transportprotein Rec des HERV-K113 steht dabei im Verdacht an der potentiellen malignen Transformation von Zellen beteiligt zu sein. Bisher konnten Überexpressionen dieses akzessorischen Proteins in Krebszellen wie Melanome oder Ovarialkarzinome sowie Protein-Protein-Interaktionen beobachtet werden, welche zu einer vermehrter Proliferation führten. In dieser Arbeit sollten die Überexpression von Rec in Pri-märzellen als Modellsystem etabliert werden um zukünftig die Auswirkungen des Proteins auf den Zellmetabolismus sowie die Schritte bis hin zur malignen Transformation untersuchen zu können. Dazu wurde das Rec-Gen mit dem bestehenden lentiviralen Transduktionssystem in die eukaryotischen Zelllinien, primären Melanocyten und Ovarienzellen geschleust. Mittels Immunfluoreszenz konnte wie erwartet im Zellkern lokalisiertes, exprimiertes Rec-Protein de-tektiert werden, auch bei den hier erstmalig untersuchten primären Zellen. In den HEK-Zellen konnten per Immunfluoreszenz ermittelte Transduktionsraten von 90 % erreicht werden. Die verstärkte Rec-Expression wurde in den Primärzellen NHEM- und OSEC von bis zu 45 % er-reicht. Bei den hier getesteten Permeabilisierungs- und Anfärbemethoden konnte exprimiertes Rec im Kern nur unvollständig angefärbt und bei der Durchflusscytometrie der Immunfluores-zenz der HEK-Zellen entsprechende Ergebnisse erlangt werden. Zur weiteren Testung der Me-thode wurden Versuche mit einer Mutante des HIV-1 Rev Proteins durchgeführt, bei der die Lokalisation durch Mutation der Kernimport bzw. –export vorgegeben war. Im Gegensatz zu dem gleich erwarteten Detektionssignal, wurde waren 5 % Unterschied zu verzeichnen. Nach der Demonstration der induzierten Rec-Überexpression sollte mittels shRNA-Vektoren die Rec-Expression ausgehend von einem Volllängen-Molekularklon von HERV-K113 durch RNA-Interferenz herunter reguliert werden. Der Knockdown-Effekt wurde mit einer Duplex real time RT-PCR gemessen. Dabei konnten erfolgreich, nach Transfektion der entsprechenden Plasmide, zwei von drei shRNA-Konstrukten die Rec-Expression bis zu 50 % ausschalten. Zu-sammen summierte sich dieser Effekt sogar zu 70 % Rec-Silencing. Im Gegensatz dazu konnte nach Transduktion von pseudotypisierten Partikeln, welche mit den sh-Konstrukten ausgestattet waren, kein eindeutiges Gen-Silencing gezeigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass durch ein lentivirales Transduktionssystem das Rec-Protein in Primärzellen überexprimiert werden kann. Das Herunterregulieren durch shRNA konnte beispielsweise in Zellinien gezeigt werden und sollte nach Optimierung der Transduktion in pri-mären Zellen genauso möglich sein. Dadurch könnten auf Transkriptom- und Proteom-Ebene andere Proteine bzw. Onkogene untersucht werden und welchen Einfluss sie bei der Regulation von Rec spielen. Somit könnten weitere Interaktionspartner des Rec endeckt und seine Funkti-on besser verstanden werden.

Especially in germ cell tumors the transcription and expression of human endogenous retrovi-rus of the HERV-K(HML-2) is upregulated. The accessory RNA export adapter protein Rec may play a not unimportant role of inducing carcinoma. However Rec expression was found in melanoma and ovarian cancer and it could be shown that there are several protein-protein-interactions with other metabolic proteins which initiate a higher cell proliferation. To create a model of Rec mediated changes in cell metabolism im primary cells, a lentiviral transduction system was used to overexpress Rec in primary cells such like melanocytes and ovarian epithelia cells. HEK 293 and Tera-1 cell lines were included as controls. Like expected, by immunofluorescence Rec-protein located in nucleoli was detected in all tested cell types, whereas 90 % of HEK and Tera-1 cells got transduced and almost 45 % of both primary cells. The detection of Rec in the sensitive flow cytometer was not comparable to immunofluores-cence data, maybe due to ineffective permeabilization of the nucleus membrane. To suppress Rec expression RNAi technique was used. Three shRNA expression plasmids were transfected in 293T cells together with a full length molecular clone of HERV-K113 and two of them showed knockdown efficiency of 50 %, respectively, whereas in combination 70 % silencing could be achieved. Gen-silencing induced by Virus-like-particle constructed with the shRNA expression could not be detected. In conclusion, it was shown that overexpression of Rec in cell lines as well as in primary cells is possible and that Rec expression at least in 293T cells can be inhibited by shRNA. With fur-ther optimization this approach can be used to understand the influence of HERV in cell me-tabolism and the way of malign transformation.