Nachweis der Interaktion zwischen Staufen-1 und den retroviralen Proteinen Rev und Rec mittels FRET-Assays

Abstract

Da Retroviren nur für wenige Proteine codieren, sind sie stark auf die Interaktion mit Wirtsproteinen angewiesen. Diese Wirt-Pathogen Interaktionen basieren auf Protein-Protein-Interaktionen (PPI). Für einige Retroviren sind diese Interaktionen für die Replikation des Virus essentiell. PPIs bieten somit gute Angriffsziele für antivirale Therapien. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Interaktion von dem humanen Protein Staufen-1 mit dem Protein Rev aus dem siamen (SIV) und humanen Immunodefizienz-Virus 1 (HIV-1) und mit Rec aus dem humanen endogenen Retrovirus K (HERV-K) mittels Fluoreszenz (Förster)- Resonanz-Energie-Transfer (FRET)- Analyse und proximity ligation assay (PLA) nachgewiesen. FRET basiert auf der Annahme, dass Energie optisch angeregter Moleküle beim Zusammentreffen mit anderen Molekülen strahlungsfrei übertragen wird. Bei der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten FRET-Methode der Photobleichung des Akzeptors wird der Akzeptor (Staufen-1-YFP) zerstört. Dies führt, wenn sich Donor und Akzeptor in unmittelbarer Nähe befinden, zu einer Zunahme der Donorfluoreszenzintensität, da der Energietransfer zum Akzeptor reduziert wurde. Um dies beobachten zu können und somit die Vermutung einer Interaktion zwischen Donor und Akzeptor aufstellen zu können, wurden die Floureszenzintensitäten des Donors und Akzeptors vor und nach der Photobleichung gemessen. Bei der PLA-Analyse werden die betrachteten Proteine mittels mit Oligonukleotiden konjugierten Antikörpern detektiert. Befinden sich die betrachteten Proteine in unmittelbarer Nähe, so können die Oligonukleotide mittels einer Ligation ligiert werden und anschließend in einer Rolling-Circle-Amplifikation-Reaktion amplifiziert werden. Die amplifizierte zirkuläre DNA kann dann mittels Fluorenzenz in situ Hybridisierung (FISH) mit fluoreszierenden Sonden nachgewiesen werden. SIV ist der Vorläufer von HIV. Ihre Morphologie und ihr Genomaufbau sind daher nahezu identisch. HIV-1 ist Ursache für das erworbene Immundefektsyndrom (AIDS). Im Gegensatz zu HIV lösten die SIV-Stämme in der für sie spezifischen Affenart jedoch keine Krankheitssymptome aus. Wenn jedoch ein SIV-Stamm eine für ihn nicht spezifische Affenart infiziert, können AIDS-ähnliche Symptome auftreten. Daher wird SIV zur Erforschung von HIV und AIDS eingesetzt. Das von HIV-1 und SIV exprimierte Protein Rev ist zuständig für den Transport ungespleißter RNAs vom Nukleus ins Cytoplasma und an der cytoplasmatische Expression der Strukturproteine beteiligt. Es ist für die Replikation des HI/SI-Virus essentiell. HERV-K ist im Genom des Menschen integriert und kann Virus-ähnliche Partikel produzieren. Wie auch HIV-1 und SIV codiert es für einen RNA-Transport-Protein. Dieser wird Rec bezeichnet, ist Rev aber nahezu identisch. HERV-K hat im Laufe der Zeit seine Infektiosität verloren, steht jedoch in Verdacht, bei der Entwicklung von Tumoren beteiligt zu sein. Hierbei gibt es Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen der Expression von Rec und der Entstehung von Keimzelltumoren. Staufen-1 ist ebenfalls ein RNA-Transport-Protein. Es besitzt vier dsRNA-Bindedomänen (RBD2 bis RBD5) und eine Tubulin-Bindedomäne (TBD). Es interagiert über seine Domänen mit Rev/Rec und trägt zur Replikation der Viren bei. Durch die FRET-Analyse mit einer Staufen-1-Verkürzungsmutante, der RBD4 und RBD5 fehlt, konnte im Rahmen dieser Arbeit festgestellt werden, dass diese Domänen für die Interaktion von Staufen-1 und Rev bzw. Rec nicht essentiell sind. Es konnten trotz des Fehlens dieser Domänen positive FRET-Übergänge beobachtet werden. Um die Interaktion zwischen Staufen-1 und Rev bzw. Rec genauer zu untersuchen, sind weitere Experimente mit Verkürzungsmutanten nötig. Ebenfalls könnten weitere FRET-Analysen aufklären, ob es Unterschiede in der Stärke der Interaktion von SIV-Rev, HIV-1-Rev und HERVK-Rec mit Staufen-1 gibt und, ob sich die Stärke der Interaktion zwischen Nukleus und Cytoplasma unterscheidet.