Establishment of a method for the detection of proviral cDNA of HERV-K(HML-2)

Abstract

Humane endogene Retroviren (HERVs) konnten viele Millionen Jahre lang Proviren in die menschliche Keimbahn integrieren. Jedoch führten im Laufe der Jahre Mutationen, Deletionen und Rekombinationen zu deren Inaktivierung. Heute haben alle bekannten HERV-Proviren die Fähigkeit zur Replikation eingebüßt. Jedoch wurden Transkripte und virale Partikel einer HERV-Gruppe (HERV-K(HML-2)) in verschiedenen kranken menschlichen Geweben nachgewiesen. Vorangegangene Studien mit rekonstruierten HERV-K(HML-2)-Viren konnten eine Infektion in gewissen Zelllinien nachweisen. Jedoch konnte keine Integration gemessen werden, was einen post-Entry, pre-Integrations-Block vermuten lässt. Bei welchem Schritt nach dem Zelleintritt dieser Block auftritt und welche zellulären Faktoren daran beteiligt sind ist unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, in infizierten Zellen HERV-K(HML-2) cDNA nachzuweisen als Hinweis auf Reverse Transkription. Untersuchungen zum Infektionsprozess von HERV-K(HML-2) mittels Plasmid-basierenden Reporterviren wurden in der Vergangenheit bereits unternommen. Jedoch bestand das Problem, dass die cDNA, also das Produkt der Reversen Transkription, nicht unterschieden werden konnte von der kontaminierenden Plasmid-DNA. Als Lösung hierfür bot sich an, eine bestimmte Mutation in die Plasmid-DNA einzufügen, welche sich –durch intramolekulare Umlagerungen während der Reversen Transkription- verdoppelt und inder cDNA gleich zwei Mal vorhanden ist. Die cDNA unterscheidet sich so in ihrer Sequenz von der Plasmid-DNA und kann mit spezifischen Primern detektiert werden. Dieses mutierte Plasmid wurde in einer vorangehenden Arbeit hergestellt und nun als Vorlage für die Produktion von HERV-K(HML-2) Reporterviren genutzt. In der vorliegenden Arbeit wurden HERV-K(HML-2) und HIV-1 Reporterviren hergestellt, welche mit zwei unterschiedlichen Hüllproteinen, Env VSV-G und HIV-1 ΔKS, pseudotypisiert wurden. Es konnte gezeigt werde, dass mit Env VSV-G pseudotypisierte Reporterviren hochinfektiös sind, während Reporterviren welche mit HIV-1 ΔKS pseudotypisiert waren, keine Infektion nachwiesen. Mittels eines Luziferase-Tests konnte ein Unterschied in der Infektion zwischen HERV-K(HML-2) und HIV-1 Reporterviren gezeigt werden, wobei das Maximum bei HERV-K(HML-2) nach 24 Stunden gemessen wurde und bei HIV-1 nach 48 Stunden. Die DNA aus den infizierten Zellen konnte isoliert und auf den Gehalt von viraler DNA untersucht werden. Hierfür wurde einerseits die real-time duplex qPCR und die droplet digital PCR angewendet. Es konnte gezeigt werde, dass sich die droplet digital PCR dank ihrer höheren Sensitivität besser für HERV-K(HML-2) Infektionsstudien eignet, da sie selbst einzelne DNA-Kopien misst. Auch konnte die Verlässlichkeit der Mutation in der U3-Region zur Unterscheidung zwischen Plasmid- und cDNA verifiziert werden.

Over the past million years, human endogenous retroviruses (HERVs) have been inserting proviruses into the human germline, a process known as endogenization. Mutations, deletions and recombinations have since resulted in a substantial decrease in functionality of these proviruses and today all known HERV proviruses have lost the ability to replicate. However, transcripts and even whole virus particles of one HERV-group, termed HERV-K(HML-2), have since been detected in various malignant human tissues. Earlier studies with a reconstructed HERV-K(HML-2) virus have demonstrated the ability of pseudotyped HML-2-based reporter viruses to infect certain cell lines. However, no evidence of reproduction could be found, suggesting a post-entry, pre-integration block of HERV-K(HML-2). The stage after cell-entry at which this block is initiated and which cellular factors are involved remain unknown. The aim of the present work was to determine whether HERV-K (HML-2) cDNA is formed, as this would be evidence of post-entry reverse transcription. In addition, the possible integration of such cDNA into the host genome was to be investigated. The HERV-K(HML-2) infection process had already been studied using plasmid-based reporter viruses. However, using such a system it is not possible to distinguish cDNA produced during reverse transcription from plasmid contamination originating from the production of the pseudotyped virus particles. One possible solution was to insert a specific mutation into the plasmid DNA that due to intramolecular relocations during reverse transcriptions is duplicated and therefore occurs twice in the cDNA. The cDNA sequence therefore differs from that of plasmid DNA and can be detected using specific primers. This mutated plasmid had been produced in a previous work and is now used for the production of HML-2-based reporter viruses. In the present work, HIV-1 and HML-2-based luciferase reporter viruses were produced that were pseudotyped with two different envelope proteins; Env VSV-G and HIV-1 ΔKS. It could be shown that Env VSV-G pseudotyped reporter viruses were highly infectious, whereas HIV-1 ΔKS pseudotyped reporter viruses were not. Using a luciferase assay, infection by these two reporter viruses was shown to differ, with HERV-K(HML-2) showing a peak after 24 hours and HIV-1 after 48 hours. DNA from cells infected with the different reporter viruses was isolated and the amount of viral DNA was compared by real-time duplex qPCR and droplet digital PCR. The droplet digital PCR appeared to be more sensitive than classic real-time qPCR and is therefore better suited for investigating HERV-K(HML-2) infection, detecting even single copies of DNA. Furthermore, it could be shown that the mutation in the U3-region is an effective approach for distinguishing between plasmid and cDNA.