Porcine endogene Retroviren und Xenotransplantation: Evaluierung des Infektionsrisikos und Strategien zur Hemmung der Virusreplikation mittels RNA-Interferenz

Abstract

Der anhaltende Engpass an Allotransplantaten macht die Suche nach einer geeigneten Alternative dringend notwendig. Ein Lösungsansatz besteht in der Transplantation porciner Zellen oder Organe auf den Menschen. Derartige Xenotransplantationen bergen momentan jedoch noch etliche Risiken, wie immunologische Abstossungsreaktionen oder physiologische Unverträglichkeiten. Zudem besteht die Gefahr einer Übertragung von porcinen Mikroorganismen auf den humanen Rezipienten. Im Unterschied zu den meisten bakteriellen und viralen Erregern des Schweins, die durch Zucht unter keimfreien Bedingungen eliminiert werden können, ist das Genom der porcinen endogenen Retroviren mit zahlreichen Kopien stabil im Genom des Schweins integriert. Phylogenetisch verwandte Retroviren, wie die Leukämieviren der Maus (MuLV) und der Katze (FeLV) induzieren im infizierten Tier Leukämien, Tumore und Immundefizienzen und zeigen somit das Gefährdungspotential einer möglichen PERV-Infektion humaner Rezipienten. Zur Risikoevaluierung von Xenotransplantationen wurden daher im Rahmen dieser Arbeit in vivo Infektionsversuche durchgeführt. Bei den Untersuchungen mit Cynomolgusasen wurde vor allem darauf geachtet, zukünftige Xenotransplantationen beim Menschen weitestgehend zu simulieren: So wurden vergleichbare pharmakologische Immunsuppressiva appliziert, zusätzlich wurde das porcine Organ in direkter Nähe zu suszeptiblem humanem Gewebe transplantiert. Bei keinem der Tiere konnte eine PERV-Infektion des simianen oder humanen Gewebes festgestellt werden. Allerdings war die Ueberlebensdauer der Versuchstiere zu kurz, um verlässliche Aussagen über die Virustransmission machen zu können, da porcine Zellen, Gewebe und Organe bei künftigen Xenotransplantationen funktionell bis zu mehreren Jahren im Körper des Patienten verbleiben sollen. Auch bei einem zweiten in vivo Infektionsversuch, bei dem porcine Langerhanssche Inselzellen in Ratten mit chemisch induziertem Diabetes transplantiert worden waren, konnte keine PERV-Transmission nachgewiesen werden. Im Laufe weiterer Untersuchungen stellte sich allerding heraus, dass zumindest die analysierten Ratten-Fibroblasten unter in vitro Bedingungen nicht für porcine endogene Retroviren permissiv sind. Um Xenotransplantationen in Zukunft sicherer gestalten zu können, wurde erstmals das Potential des relativ neu entdeckten Phänomens der RNA-Interferenz hinsichtlich einer antiviralen Strategie gegen die Replikation von PERV analysiert: Anhand von neun unterschiedlichen synthetischen siRNAs gelang es, eine optimale Target-Sequenz in der pol-Region des PERV-Genoms (pol2) zu identifizieren, so dass die PERV Expression in PERV infizierten humanen 293-Zellen um mehr als 80% inhibiert werden konnte. Ausgehend von dieser pol2 siRNA-Sequenz wurde ein Plasmid mit einer shRNA-Expressionskassette konstruiert, das nach stabiler Transfektion eine starke und dauerhafte Hemmung der PERV-Expression hervorrief. Sowohl die mRNA, die viralen Proteine und vor allem die Menge freigesetzter infektiöser Viruspartikel war reduziert. Für die Herstellung transgener Schweine mit verminderter PERV-Expression empfiehlt sich der Einsatz lentiviraler Expressionsvektoren, um die shRNA-Expressionskassette effektiv in porcine Blastocysten transferieren zu können. Es gelang, ein entsprechendes auf HIV-1 basierendes lentivirales Vektorsystem herzustellen. Durch Infektion mit solchen nicht-replizierenden Viren konnte die Expression von PERV in humanen, aber auch in primären porcinen Zellen um 90% inhibiert werden. Somit konnte erstmals die Hemmung endogener Retroviren mittels RNA-Interferenz gezeigt werden. Mit diesen Ergebnissen ist der Grundstein für die Herstellung entsprechender transgener Tiere gelegt. Durch die Klonierung und Expression des p27Gag-Proteins und der Generierung spezifscher Antikörper gegen das rekombinante Gag-Protein sowie der Klonierung und Sequenzierung eines PERV-A/C Molekularklons wurden weitere Vorrausetzungen geschaffen, um das Risikopotential zukünftiger Xenotransplantationen hinsichtlich einer Virustransmission mit den porcinen endogenen Retroviren besser einschätzen zu können.