Expression und Analyse retroviraler immunsuppressiver Doma nen auf humanen Zellen

Abstract

Eine Vielzahl von Retroviren sind in der Lage, das Immunsystem des Wirtes durch verschiedene Mechanismen zu beeinflussen. Die isu-Domäne als ein Teil der retroviralen TM-Proteine p15E (PERV, MuLV), sowie gp41 (HIV-1) beispielsweise, ist in der Lage, die Zytokinexpression in PBMCs zu beeinflussen. So werden anti-inflammatorische Zytokine, wie das Interleukin-10 (IL-10) verstärkt exprimiert. Die am RKI entwickelten Proteinexpressionssysteme pOUT und tANCHOR wurden für die Expression der isu-Domäne in HEK293T verwendet. Das pOUT-System nutzt das Signalpeptid der Gaussia princeps Luciferase zur Sekretion des pOUT-Proteins in das Zellmedium. Das tANCHOR-System wiederum besteht aus dem Tetraspanin CD82, dessen large extracellular loop (LEL) durch die isu-Domäne von PERV oder HIV ersetzt wurde und diese somit auf der Zelloberfläche präsentiert wird. Beide Expressionssysteme beinhalten neben der isu-Sequenz einen Proteintag bzw. Sequenz des mCherry Fluoreszenzproteins, die eine Detektion durch Western Blot-Analyse und Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht. Beide Methoden konnten eine Expression des pOUT-, bzw. tANCHOR-Proteins belegen. Partikel des MuL-Virus wurden durch Ultrazentrifugation pelletiert und durch Western Blot-Analysen charakterisiert. Es konnten die virusspezifischen Proteine Gag, p15E und gp70 nachgewiesen werden. Daneben wurden Exosomen der mit tANCHOR-Protein transfizierten Zellen durch Ultrazentrifugation konzentriert und auf die Markerproteine CD9 und CD81, sowie auf das CD82ΔLEL-isu-mCherry-Potein erfolgreich getestet. Die Immunsuppression durch die isu-Domäne sollte anhand einer IL-10-Induktion untersucht werden. Die Exosomen, konzentriertes MuLV-Protein, pOUT-sekretierende Zellen, sowie das durch kommerzielle His-Tag Dynabeads® isolierte pOUT-Protein wurden auf IL-10-Induktion in isolierten PBMCs durch einen ELISA untersucht. Das pOUT-Protein bewirkte keine IL-10-Induktion. Die Exosomen transfizierter Zellen, sowie die MuLV-Partikel zeigten eine IL-10-Induktion, welche sich von der Kontrolle aus dem Pellet von Exosomen uninfizierter, bzw. virusfreier Zellen signifikant unterschied. Die aus mutierter isu-Domäne bestehende Kontrolle zeigte jedoch ebenfalls eine Induktion des Zytokins. Derzeit ist unklar, warum auch die Mutanten in der isu-Domäne IL-10 induzieren.