Analyse von HIV-1 Restriktionsfaktorenkandidaten, die nach Aktivierung der Toll-like Rezeptoren 7 und 8 induziert werden

Abstract

Bereits 1983 ist erstmals der Typ 1 des Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) beschrieben worden. Bisher besteht keine Chance auf Heilung. Verfügbare Medikamente schaffen es zwar, den Virustiter unter die Nachweisbarkeitsgrenze zu bringen, aber das Virus kann sich nach Absetzen der Medika-mente wieder ausbreiten. Grund dafür ist die Reservoirebildung von HIV in inaktivierten Gedächtnis-zellen. Die angeborene Immunantwort des Körpers gegen das HI-Virus wird, noch bevor das adaptive Immunsystem involviert ist, aktiviert und könnte neue Behandlungsansätze liefern. Ein Teil dieser natürlichen Immunantwort sind die Restriktionsfaktoren. Diese zellulären, antiviralen Proteine sind ein Teil unserer angeborenen Immunantwort gegen virale Infektionen. Das Finden und Untersuchen von weiteren Restriktionsfaktoren könnte daher vielversprechend für die HIV-Forschung sein. Die Expres-sion von Restriktionsfaktoren wird oft stimuliert, nachdem die Zelle durch Mustererkennungsrezepto-ren (pattern recognition receptors, PRR) pathogen assoziierte molekulare Muster (PAMP) detektiert hat. Eine Familie solcher PRRs sind die Toll-like Rezeptoren (TLR). Es wurde bereits gezeigt, dass die TLR 7/8 das virale Genom von HIV erkennen können, und dass die Stimulierung von TLR7/8 durch einen Agonisten (Resiquimod, R848) eine HIV-1 Restriktion hervorruft. Dieser antivirale Block ist neuartig und kann keinem der bisher bekannten Restriktionsfaktoren zugeordnet werden. Ziel dieser Arbeit ist es, mögliche Kandidaten für diesen unbekannten Restriktionsfaktor auf deren antivirale Ak-tivität zu testen. Mittels eines Illumina RNA-Tiefen-Sequenz-Screenings wurde eine Transkriptom-Analyse durchgeführt. Die Analyse identifiziert und ordnet hochregulierte Gene ihrer Expressionsstär-ke nach Stimulierung der TLR7/8. In dieser Arbeit wurden nun acht hochregulierte Gene ausgewählt und analysiert, die die bislang unbekannte TLR 7/8 Restriktion gegen HIV-1 verursachen könnten. Kriterien von diesen acht Genen waren Proteindomänen von bekannten Restriktionsfaktoren, wie die SAM-Domäne, oder bekannte katalytische Aktivitäten der Genprodukte, wie z.B. Ubiquitin Ligase Aktivität. Daraus resultierte die Selektion der Gene SAMD9, SAMD9L, SAMSN1, LAP3, UBE2L6, CMPK2 und HERC5. Um diese als genetisches Material zu erhalten, wurden aus primären humanen R848-stimulierten Monozyten die RNA isoliert und in die komplementäre DNA (cDNA) umgeschrie-ben. Die Gene wurden aus der cDNA amplifiziert und in ein lentivirales Vektorkonstrukt kloniert. Die Expression wurde in HEK-293T Zellen getestet. In ein Experiment wurde nun mit pseudotypisierten GFP und Luciferase-Reporterviren die Infektiosität in HEK-293T der gewählten Gene mit einem Kon-trollplasmid verglichen werden. In HEK-293T Zellen zeigte dies keinen signifikanten Unterschied zu dem Kontrollplasmid. Bislang konnte daher die unbekannte Restriktion noch nicht identifiziert wer-den. Um die Restriktionsfaktorenkandidaten definitiv auszuschließen, werden noch weitere Untersu-chungen in monozytären Zelllinien, wie die U937 Zelllinie, vonnöten sein. Die Entdeckung eines neu-artigen Restriktionsfaktors würde das Verständnis des Replikationszyklus von HIV weiter aufschlüsseln und vielleicht einen Ansatz für eine Therapie liefern.

Since the description of the type 1 of the human immunodeficiency virus (HIV) in 1983, potent an-tiretroviral drugs are available that reduce the virus level under the detection limit. However, after discontinuation of the medication the infection breaks out again. The reason for that is the formation of HIV reservoirs in inactive memory-cells. The innate immune response of the body takes action before the adaptive immune system is involved and may allow for new treatment approaches. One part of the innate immune response are the so called restriction factors. These are cellular antiviral proteins that act against viral infections. To find and study new restriction factors can be a promising approach for HIV treatment. The cellular expression of restriction factors is often induced after the pattern recognition receptors (PRR) are stimulated by pathogen-associated molecular patterns (PAMP). One protein family PRRs are the toll-like receptors (TLR). It has already been shown that TLR 7/8 can recognize the viral RNA genome of HIV and that the simulation of TLR 7/8 by their agonist (resiquimod, R848) results in the restriction of HIV-1. This antiviral block is novel and cannot be as-sociated with any of the known restriction factors. The goal of this bachelor thesis is to find possible candidates for this unknown restriction factor and test there antiviral activity. Through illumina deep RNA sequencing a transcriptome analysis was performed. The analysis identified upregulated genes of and ranked those based on their expression level after stimulation with TLR 7/8. In this bachelor thesis We choose eight upregulated genes and analyszed their antiviral activity against HIV-1. Criteria for choosing these eight candidates were protein domains similar to those of known restriction factors like the SAM-domain or their catalytic activity such as ubiquitin ligase activity. We selected the genes SAMD9, SAMD9L, SAMSN1, LAP3, UBE2L6, CMPK2 and HERC5. To get the genetic material of these genes I isolated RNA from primary human monocytes that were stimulated by R848 and tran-scribed the mRNA into complimentary DNA (cDNA). Using the cDNA I amplified the genes of inter-est and cloned them into a lentiviral construct. The expression was tested in HEK-293T cells. Using pseudo-typed GFP and lucifrease reporter virus I tested the infectivity of HIV-1 in HEK-293T cells transfected with the expression plasmids of the chosen genes of interest. None of the genes picked showed a significant antiviral activity compared to the control plasmid in HEK293T cells. In future experiments it will essential to test the antiviral activity of these gens in a cell line closer to human monocytes, such as the monocytic U937 cells. The discovery of a novel restriction factor would im-prove our understanding of the replication cycle of HIV and may allow for a new approach for antivi-ral therapy.