Etablierung einer subtypgenerischen HIV-1 envelope PCR zur Bestimmung des Korezeptor-Tropismus aus Plasma und dried fluid spots

Abstract

Die Entwicklung antiretroviraler Medikamente förderte in den letzten Jahren sowohl die Prävention von HIV als auch die Verbesserung des Krankheitsbildes infizierter Patienten. Im Angesicht, der sich entwickelnden Resistenzen gegenüber antiretroviraler Medikamente, ist es notwendig die Forschung diesbezüglich zu vertiefen. Das Wissen über die Expression und Regulation der Korezeptoren ist von großer Bedeutung für das Verstehen der HIV Pathogenität. Das Ziel dieser Arbeit war es ein einfaches und robustes polymerase Kettenreaktion Setup (polymerase chain reaction, PCR) zu etablieren, um von HIV-positivem Plasma als auch von getrockneten Serum Proben der Serokonverterstudie bzw. der Molekularen Surveillance den HIV Korezeptorgebrauch zu bestimmen. Dazu wurde im Rahmen dieser Arbeit eine subtypgenerische full-length envelope PCR etabliert. Diese ist in der Lage, den gesamten env open reading frame zu amplifizieren, sodass die viralen Glykoproteine gp120 und gp41 aus humanem Plasma sequenziert werden können. Die Arbeit umfasst weiterhin die Etablierung einer hochsensitiven PCR zur Amplifikation des gp120 V3-loops und dessen Sequenzierung durch Next Generation Sequencing (NGS, Illumina). Die Erforschung des Korezeptor-Tropismus erfolgte auf Grundlage des V3-loops und ermöglichte es, den Korezeptorgebrauch der Infektionsdauer gegenüberzustellen. In dieser Arbeit konnten erfolgreich zwei PCR-Setups etabliert werden, um diese Fragenstellung, besonders im Zuge der Umstellung auf NGS basierte Verfahren, zu ermöglichen. Für filtergetrocknetes Material konnte eine sehr gute Nachweisgrenze von 102 Kop./mL für das 500 Bp Amplikon und für das 3200 Bp Amplikon der Plasmaproben eine ausreichend gute Nachweisgrenze von 103 Kop./mL erreicht werden. Die Sequenzierung des full-length env mittels NGS war erfolgreich und eine Ableitung des Korezeptorgebrauchs war bis zu einem Minoritätengrenzwert von bis zu 3 % möglich. Das etablierte PCR-Setup wird einen wichtigen Beitrag leisten, um den Anteil übertragener X4-Troper Viren zu berechnen. Die Nutzung von Maraviroc als Korezeptorantagonist zur Behandlung von HIV-1 Infektionen unterstreicht die Wichtigkeit eines aufmerksamen klinischen Monitorings der virologischen Antwort eines unter Therapie stehenden Patienten.

Over the last years, the development of antiretroviral Medication supported the prevention of HIV and improved the living conditions of infected patients. Due to evolving antiretroviral resistances, it is necessary to expand the concerning research. The knowledge about expression and regulation of coreceptors is of major value for understanding the HIV pathogenicity. The aim of this work was to establish a simple and robust polymerase chain reaction (PCR) setup to determine the HIV coreceptor use of both the HIV positive plasma and dried serum spots found in the samples of the seroconverter study and molecular surveillance, respectively. This was done by establishing a subtype generic full-length envelope PCR that is capable to amplify the entire env open reading frame to sequence the viral glycoproteins gp120 and gp41 from human plasma. Furthermore, this work includes an establishment of a high sensitive PCR to amplify the gp120 V3-loop and furthermore sequencing this fragment with next generation sequencing (NGS, Illumina). The exploration of coreceptor tropism was based on the V3-loop fragment and enabled the comparison of coreceptor use to the duration of infection. For this research question, especially for the transition to NGS based methods, two PCR setups were successfully established. A very good detection limit of 102 cop./mL was achieved for filter dried material with 500 bp amplicon and a sufficiently well detection limit of 103 cop./mL for plasma samples with a 3200 bp amplicon for subtype B reference strain. The NGS sequencing of the full-length env was successful and a derivation of the coreceptor usage was possible up to a minority limit of 3 %. However, the established PCR setup will play an important role for the proportion calculation of transferred X4-tropic viruses. The use of maraviroc as coreceptor-antagonist for treatment of HIV-1 infections emphasises the importance of an attentive clinical monitoring of the virological answer of patients under treatment.