Analyse der post-entry Prozesse des rekonstituierten humanen endogenen Retrovirus HERV-K113 im Vergleich zu weiteren Beta-Retroviren

Abstract

Das humane Genom besteht zu etwa 8% aus retroviralen Sequenzen, den Humanen Endogenen Retroviren (HERV). Davon umfasst die HERV-K(HML-2) Familie die jüngst integrierten Elemente und ist die einzige Gruppe, welche humanspezifische Proviren enthält. Mit HERV-K113 wurde ein Provirus entdeckt, welches vollständige offene Leserahmen für alle viralen Proteine enthält, jedoch aufgrund post-insertionaler Mutationen keine infektiösen Viruspartikel mehr bilden kann. Trotz zahlreicher Nachforschungen konnte bisher kein replikationskompetentes Provirus im Menschen nachgewiesen werden. Das Verschwinden der exogenen Vorläufer kann unter anderem auf zelluläre Restriktionsprozesse, die offenbar während des post-entry/ pre-Integrationsprozesses stattfinden, zurückgeführt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden zur genaueren Charakterisierung der post-entry Inhibition von HERV-K(HML-2) und auch für die eng verwandten Beta-Retroviren MMTV und JSRV geeignete Methoden etabliert und Infektionsversuche mit Detektion von Zwischenprodukten der Reversen Transkription durchgeführt. Dafür wurden zunächst zwei verschiedene, auf rekonstituierten HERV-K113 Sequenzen basierte Reportervirussysteme zur Produktion von „virus-like particles“ (VLPs) in verschiedenen Kombinationen eingesetzt und hinsichtlich ihrer viralen RNA Kopien, dem p27 Gehalt und der RT-Aktivität charakterisiert und verglichen. Aufgrund der gewonnenen Daten wurden oriHERV-GFP und HERV-KCON, zusammen mit dem Verpackungsplasmid oricoGPP, für die VLP Produktion ausgewählt. Weiterhin wurden sogenannte Slippery Site Mutanten generiert, welche durch Mutation der Slippery Sequenz(en) eine bzw. beide ribosomale Leserahmenverschiebungen nicht mehr für die Synthese der Vorläuferproteine benötigen. In diesen VLP-Mutanten sollte sich das Verhältnis der Vorläuferproteine zueinander verschieben lassen, sodass VLPs mit einem optimierten Partikel-zu-RT-Aktivität Verhältnis entstehen. Nach Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass die Gag-Pro-Pol Doppelmutante zur stärksten RT-Aktivität in den enthaltenen VLPs führte, während die Menge an VLPs bezüglich p27 zu gering war. Für die Infektionsversuche wurden diese Mutanten aus diesem Grund nicht verwendet. Zusätzlich zu den HERV-K(HML-2) Reporterviren erfolgte die Produktion und Charakterisierung von MMTV- und JSRV-Partikeln, welche ebenfalls in die Infektion eingesetzt wurden. Dazu wurde für MMTV ein bereits publiziertes Vektor-basiertes Reportervirussystem etabliert. Die Etablierung der neuen qPCR Systeme zur Untersuchung der RT-Produkte für MMTV und JSRV war ebenfalls notwendig, während diese für HERV-K schon bestanden. Die ddPCR wurde etabliert und für bestimmte RT-Produkte zur Bestätigung der qPCR eingesetzt. Nach der Produktion und Charakterisierung der Reporterviren erfolgte die synchronisierte Infektion von CRFK Zellen. Diese wurden zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infektion geerntet. Die extrahierte DNA der infizierten Zellen wurde sodann auf die verschiedenen RT-Produkte mithilfe spezieller Primer-Sonden Kombinationen in der real-time PCR untersucht. Anhand der Nachweisbarkeit der early und late RT-Produkte bei den mit HERV-K- sowie MMTV- und JSRV-infizierten Zellen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Reverse Transkription in den infizierten Zellen zunächst einmal bis zum Kernimport stattfindet. In Zellen, die mit MMTV bzw. JSRV infiziert waren, konnte jedoch nicht, wie erwartet, der gesamte post-entry Prozess bis hin zur Integration der Proviren demonstriert werden. Dennoch konnten einzelne Kopien der 2-LTR-circles detektiert werden. Die chromosomale Integration konnte bei keiner der infizierten Zellen nachgewiesen werden. Nicht detektierte RT-Produkte könnten eine Inhibierung durch zelluläre Restriktionsfaktoren bedeuten, was bei HERV-K(HML-2) wahrscheinlich ist.

The human genome consists of about 8 % of retroviral sequences, the Human Endogenous Retroviruses (HERV). Of these, the HERV-K (HML-2) family includes the most recently integrated elements and is the only group containing human-specific proviruses. HERV-K113 is a provirus, which contains complete open reading frames for all viral proteins, but can no longer form infectious virus particles due to post-insertional mutations. Despite of numerous investigations, no replication-competent provirus has been detected in humans so far. The vanishing of the exogenous precursors can, among others, be attributed to cellular restriction processes that appear to occur during the post-entry/ pre-integration process. In the present work new methods were established and used for infection experiments, resulting in the detection of early and late products of reverse transcription to further characterize the post-entry inhibition of HERV-K(HML-2). For comparison, the closely related beta-retroviruses MMTV and JSRV were included in these experiments. At first, two different reporter virus systems based on reconstituted HERV-K113 sequences were used in various combinations for the production of virus-like particles (VLPs) and characterized and compared in terms of their viral RNA copies, p27 content and RT-activity. Due to the obtained data, oriHERV-GFP and HERV-KCON in combination with the packaging plasmid oricoGPP were selected for the VLP production. Furthermore, so-called slippery site mutants were generated, which, by mutation of the slippery sequence(s), no longer require one or both ribosomal frameshifts for the synthesis of the precursor proteins. In these VLP mutants, the ratio of precursor proteins should get shifted, resulting in VLPs with an optimized particle-to-RT-activity ratio. After characterization it could be shown that the Gag-Pro-Pol double mutant led to the highest RT-activity in the VLPs, while the amount of VLPs was too low with respect to p27. For this reason, the slippery site mutants were not used for the infection experiments. In addition to the HERV-K(HML-2) reporter viruses, the production and characterization of MMTV and JSRV particles was carried out. For this purpose, an already published vector-based reporter virus system was established for MMTV as well as new qPCR systems for the detection of RT products for MMTV and JSRV. Furthermore, ddPCR was established and used to detect certain RT products, confirming the qPCR. After the production and characterization of the reporter viruses, the synchronized infection of CRFK cells was performed. CRFK cells were harvested at certain time points after infection. The extracted DNA of the infected cells was then analyzed for the different RT products using specific primer-probe combinations in real-time PCR. Based on the detectability of the early and late RT products in the cells infected with HERV-K as well as MMTV and JSRV, it could be shown in this thesis that the reverse transcription takes place at least up to the nuclear import. Using this strategy it was expected to demonstrate the entire post-entry process including the integration of the provirus in cells infected with MMTV or JSRV, however, this was not possible like published before. Nevertheless, single copies of the 2-LTR circles could be detected. Chromosomal integration could not be detected in any of the infected cells. This could be due to the inhibition of the post-entry process by cellular restriction factors, which is likely in the case of HERV-K(HML-2).