Untersuchungen zur reversen Transkription und dem Kerneintritt von HERV-K(HML-2)

Abstract

Das menschliche Genom besteht zu 8% aus retroviralen Sequenzen. Die Unterfamilie HML-2 von HERV-K ist dabei die einzige Linie, die seit der Divergenz zwischen Menschen und Schim-panse im menschlichen Genom repliziert hat. Viele der Loci sind in der menschlichen Popu-lation nicht fixiert, haben intakte Open Reading Frames (ORF) und wenig oder keinen Se-quenzunterschied zwischen den flankierenden LTRs, welche bei der Integration absolut iden-tisch sind (Belshaw und Tristem 2009). Trotzdem konnten bisher keine replikationskompeten-ten endogenen HERVs im menschlichen Genom identifiziert werden, was vermuten lässt, dass es einen Postentry/ Preintegration Block gibt. Zur genaueren Untersuchung möglicher Rest-riktionsprozesse von HERV-K(HML-2) wurden Methoden und Infektionsversuche etabliert, um Prozesse der Reversen Transkription und des Kerneintritts genauer zu analysieren. Um die Sensitivität für Infektionsexperimente zu verstärken, wurde hierfür zunächst das auf dem HERV-Kcon- Molekularklon codierte EGFP-Reportergen gegen die Luciferase ausge-tauscht. Anhand eines Infektionsexperimentes konnte für beide Reportersysteme gezeigt wer-den, dass bei den humanen Zelllinien HEK293T und HeLa eine stabile Reporteraktivität nach-gewiesen werden kann. Dies lässt nicht nur eine stabile Integration des Reportergens vermu-ten, sondern spricht auch dafür, dass Prozesse auf Ebene des Kerneintritts erfolgreich durch-laufen werden. Des Weiteren wurden die Reporterviren zur Identifikation zellulärer Restriktionsfaktoren ein-gesetzt. In Anlehnung an ein Infektionsexperiment von Kramer et al. sollte die Hypothese über-prüft werden, ob es zelluläre Restriktionen gegen HERV-K(HML-2) gibt, welche durch Koinfektion mit einem anderen Virus aufgehoben werden können. Der Effekt der Inhibitorsättigung, welcher in der Vergangenheit mit CMVoriLuc-basierten Reporterviren beobachtet wurde, konnte im Rahmen des Experiments mit HERV-Kcon nicht nachgewiesen werden (Kramer et al. 2016). Zudem wurden Prozesse auf Ebene der Reversen Transkription näher untersucht. Hierzu galt es virale cDNA als Produkt der reversen Transkription nachzuweisen. Um zu verhindern, dass anstatt viraler cDNA kontaminierende Plasmid-DNA detektiert wird, wurde eine kurze Markersequenz in die U3-Region der 3´LTR eingefügt. Da diese während der Reversen Transkription durch intramolekulare Umlagerungen verdoppelt wird, ist diese in der viralen genomischen cDNA sowohl in der 3´LTR, als auch 5´LTR vorhanden und unterscheidet sich damit von der Sequenz der Plasmid-DNA. Mit dieser Methode konnte gezeigt werden, dass spezifisch virale cDNA in HEK293T nachgewiesen werden kann und die Mutation in der U3-Region als ein geeignetes Tool für den Nachweis viraler cDNA dient. Die Vermutung über Restriktionen auf Ebene der Reversen Transkription können damit für die humane Zelllinie HEK293T widerlegt werden.

The human genome consists of 8% retroviral sequences. The HML-2 subfamily of HERV-K is the only lineage that has replicated in the human genome since the divergence between humans and chimpanzees. Many of the loci are not fixed in the human population, have intact open reading frames (ORF) and little or no sequence difference between the flanking LTRs, which are absolutely identical upon integration (Belshaw und Tristem 2009). Despite numerous studies, no replication-competent endogenous HERVs have yet been identified in the human genome, suggesting that there is a post-entry/pre-integration block. To precisely study possible restriction processes of HERV-K(HML-2), methods and infection experiments were established to analyze the process of reverse transcription and nuclear entry. To improve the sensitivity for infection experiments, the EGFP-reporter gene encoded on the HERV-Kcon molecular clone was exchanged for the luciferase gene. Based on a long-term infection experiment, it was successfully demonstrated for each reporter system that stable reporter activity can be detected in the human cell lines HEK293T and HeLa. This not only indicates a stable integration of the reporter gene, but also suggests that processes at the level of nuclear entry are being successfully completed. Furthermore, the reporter viruses were used to identify cellular restriction factors. In accordance with an infection experiment by Kramer et al., the hypothesis was verified whether there are cellular restrictions against HERV-K(HML-2), which can be abrogated by coinfection with another virus. The effect of inhibitor saturation, which was observed in the past with CMVoriLuc-based reporter viruses, could not be demonstrated in the infection experiment with HERV-Kcon (Kramer et al. 2016). In addition, processes at the level of reverse transcription were investigated. The aim was to detect viral cDNA as a product of reverse transcription. To prevent contaminating plasmid DNA from being detected instead of viral cDNA, a short marker sequence was inserted into the U3-region of the 3'LTR. Since the mutated sequence is duplicated during reverse transcription by intramolecular rearrangements, it is present in both, the 3'LTR and 5'LTR, and can thus be distinguished from the contaminating plasmid DNA. This method successfully demonstrated that the mutation in the U3-region is an effective tool to specifically detect viral cDNA by a PCR system. The hypothesis about restrictions at the level of reverse transcription can thus be disproved for the cell line HEK293T.