Expression and purification of the primate foamy virus transmembrane envelope protein

Abstract

Seit dem Nachweis breit neutralisierender Antikörper (bNAb), welche von HIV-infizierten Menschen gebildet werden können, konzentrieren sich viele Ansätze auf die Induktion solcher Antikörper zur Entwicklung eines HIV Impfstoffes. Zwei der am besten charakterisierten Antikörper in diesem Zusammenhang sind 2F5 und 4E10. Sie binden an konservierte Bereiche im transmembranen Hüllprotein (TM Protein) gp41 von HIV und neutralisieren bis zu 95% primärer HIV-Isolate, gängige Immunisierungsstrategien waren hier jedoch bisher nicht erfolgreich. Die Entwicklung alternativer Strategien ist daher notwendig. In dieser Arbeitsgruppe erzielte Ergebnisse zeigen, dass die Immunisierung mit dem TM Protein verschiedener Retroviren wie dem Porcinen Endogenen Retrovirus (PERV), dem Katzen-Leukämie-Virus (FeLV) und dem Koala Retrovirus (KoRV) zur Induktion neutralisierender Antikörper führt. Die gebildeten Antikörper richten sich dabei gegen eine ähnliche Region im TM Protein, wie 2F5 und 4E10. Die daraus entstandene Idee, das TM Protein verschiedener Retroviren als Träger für HIV Epitope zu verwenden, wird derzeit in der Gruppe untersucht. Foamyviren besitzen zahlreiche Eigenschaften, die sie als potentiellen Impfstoffvektor interessant machen. Dazu gehören ihre Apathogenität, ihre hohe Verpackungskapazität und das Fehlen präexistierender Antikörper in infizierten Individuen. Als Vorraussetzung für die Konstruktion rekombinanter Foamyviren mit modifiziertem TM Protein, ist die Charakterisierung der immunogenen Bereiche durch Epitopmapping notwendig. Ziel dieser Arbeit war es daher, das TM Protein des Primatenfoamyvirus (PFV) erfolgreich zu exprimieren und in großen Mengen aufzureinigen, um Immuniserungsstudien zu ermöglichen. In einem ersten Versuch wurde dafür ein Plasmidkonstrukt verwendet, welches die Ektodomäne des PFV-TM Proteins als GSTFusionsprotein exprimierte. Trotz Expressionsoptimierung konnte das Protein nur in unlöslicher Form gewonnen werden. Der Versuch, das Protein durch Detergenzien wieder in Lösung zu bringen war zwar erfolgreich, eine Aufreinigung des resolubilisierten Proteins war unter den getesteten Bedingungen jedoch nur bedingt möglich. Daher wurden Plasmidkonstrukte mit C-terminal angehängtem His-Tag generiert. Aufgrund der zuvor optimierten Bedingungen führte dieser Ansatz zu einer hervorragenden Expressionsrate und der erfolgreichen Aufreinigung von über 90% reinem Protein, welches für spätere Immunisierungen verwendet werden kann. Des Weiteren ist es gelungen, geringe Mengen Protein unter nicht denaturierenden Bedingungen zu gewinnen. Mögliche immunologische Unterschiede zwischen diesem und Detergenz- aufgereinigtem TM Protein, bedingt durch konformationelle Unterschiede, können so untersucht werden.

Since broadly neutralizing antibodies (bNAbs) were found to be produced in HIV-infected individuals, recent strategies towards a HIV-vaccine focus on the induction of such antibodies. 2F5 and 4E10, two of the best characterized bNAbs, neutralize up to 95% of primary HIVisolates and are directed against the highly conserved membrane proximal external region (MPER) of the transmembrane envelope protein (TM protein) gp41. However, despite intense efforts all immunization strategies to induce these antibodies remained unsuccessful to date. Therefore, alternative strategies have to be investigated. Results of our group showed that the immunization with the TM of different retroviruses, such as the porcine endogenous retrovirus (PERV), the feline leukemia virus (FeLV) and the Koala retrovirus (KoRV) led to the induction of bNAbs. Interestingly, those antibodies reacted similarly as 2F5 and 4E10 with the MPER. Therefore, our project group is investigating the use of the TM proteins of different retroviruses as a carrier for the epitopes of HIV. Foamy viruses have several properties which makes them very suitable as a potential vaccine vector. They are apathogenic, have high packaging capacity for the uptake of foreign DNA and, due to their low prevalence in humans, avoid the risk of pre-existing antibodies interfering with the immunization success. As a prerequisite for using recombinant foamy viruses utilizing modified TM proteins, the characterization of the immunogenic regions is necessary. The objectives of this work were therefore the expression and purification of foamy virus TM protein for the later use in immunization studies. As a first attempt a plasmid construct expressing the ectodomain of the primate foamy virus (PFV) TM protein as a GST-fusion protein was used. Despite intense expression optimization the recombinant protein remained insoluble. Although experiments aimed to resolubilize the protein using detergents were successful, the purification thereof was not satisfying. Thus, plasmid constructs containing a C-terminal His-tag were generated. Using the previously optimized conditions, this approach allowed high expression rates and successful purification of recombinant protein with purity above 90%. Furthermore, it was possible to obtain small amounts of purified TM protein under non-denaturing conditions, which will be useful for determination of variation of the humoral immune response, possibly caused by conformational differences.