Funktion der transmembranen Hüllproteine von Retroviren bei der Pathogenese

Abstract

Der Mechanismus der Immunsuppression durch viele Retroviren ist nur in Ansätzen verstanden. Es gibt einige Hinweise auf eine Beteiligung der transmembranen Hüllproteine an der Modulation der Immunzellen. In dieser Arbeit wurde der Versuch unternommen, den Einfluss der beiden TM-Proteine rp15E von FeLV und gp41 von HIV-1 bei der Pathogenese der Immunschwächen näher zu charakterisieren. Die immunsuppressive Domäne von gp41 wurde in Form des abgeleiteten ISU-Peptids durch Crosslinking polymerisiert und ebenfalls auf seine modulierende Wirkung hin untersucht. Mithilfe der Säulenaffinitätschromatographie und einer Affinitätspräzipitation mit magnetischen Beads konnten verschiedene potentielle Bindungspartner des rekombinanten p15E von FeLV isoliert werden. Als putative Bindungspartnern wurden Nucleolin, β-Aktin und GAPDH durch MS/MS-Sequenzierung und mit Western Blot Analysen identifiziert. Die Untersuchung der IL-10 Induktion durch rp15E und gp41 zeigte bei beiden Proteinen einen Anstieg des IL-10 Titers im Kulturüberstand. Zudem konnte die Aktivierung von Typ 2 Cytokinen mithilfe des Cytokinarrays nachgewiesen werden. Hierzu zählt die Aktivierung von IL-6, IL-10 und der Chemokine GRO und GRO-α. Hingegen wurden die typischen Typ 1 Cytokine wie IL-2, IL-5 und auch IFN-γ und TNF-α in beiden Fällen gehemmt. Ein schwerwiegendes Problem stellte die Kontamination des rekombinanten p15E mit bakteriellem Endotoxin dar, das mit obigen Assays interferiert. Dieses Problem konnte auch durch eine spezielle Affinitätschromatographie zur Endotoxinabreicherung nicht gelöst werden. Um dieses Problem in Zukunft zu umgehen, wurde in dieser Arbeit einerseits ein Drosophila- Expressionsystem etabliert, mithilfe dessen das rekombinante p15E des porcinen endogen Retrovirus- A (PERV-A) in Drosophila Schneider 2-Zellen exprimiert und sezerniert werden konnte. Diese Methode wird in Zukunft die Verwendung rekombinanter TM-Proteine deutlich erleichtern. Andererseits wurde mit der Etablierung eines transgenen Tumormodells begonnen. Hierfür wurden 293-Karzinomzellen mit unterschiedlichen gp41-Plasmidkonstrukten transfiziert und selektioniert. Die Oberflächenexpression von rekombinantem gp41 konnte mithilfe der Immundurchflusscytometrie nachgewiesen werden. Die erhaltenen, stabil transfizierten Zellen können in Zukunft für in vivo Studien im Mausmodell verwendet werden. Es konnten in dieser Arbeit weitere Beweise für eine Beteiligung der retroviralen TM-Proteine und ihrer ISU-Peptide bei der Pathogenese erhalten werden. Die Isolierung putativer Bindungsproteine und der Nachweis der Cytokinmodulation sprechen für eine Immunsuppression durch die spezifische Aktivierung regulatorischer Cytokine wie IL-10.