Vaccination studies with the mper of HIV-1 gp41 grafted into transmembrane protein of a gammaretrovirus

Abstract

Eine der größten Herausforderungen in der Impfstoffentwicklung weltweit ist die Entwicklung eines Impfstoffs gegen HIV-1 um damit die HIV-1 Pandemie einzudämmen ist. Obwohl hohe Summen für Forschungsmitteln auf diesem Gebiet investiert werden, konnte bis heute kein Antigen und kein effektiver Immunsierungsplan gefunden werden, welche die Infektion mit dem Retrovirus komplett verhindern kann. In dieser Arbeit wurde eine Strategie gewählt, die auf Immunisierungsstudien mit Hybridproteinen basiert. Für diese Studien wurden redombinante Hybridproteine produziert, die aus Sequenzen des transmembranen Hüllprotein von HIV-1 und jenem des porcinen endogenen Retrovirus (PERV) bestehen. Das transmembrane Hüllprotein p15E von PERV wurde hier als Proteingerüst verwendet, da in Immunisierungsstudien mit der Ektodomäne von p15E in verschiedenen Tierspezies die Induktion von neutralisierenden Antikörpern gezeigt werden konnte. Jene PERV neutralisierenden Seren erkannten sowohl Epitope in der fusionspeptid-proximalen Region (FPPR), als auch in der membrane-proximalen externen Region (MPER) des transmembranen Hüllproteins. Alignments von gp41 und p15E zeigten eine Sequenzhomologie in der MPER (F/YEGWFN bei PERV und NWFNIT, im 4E10 Epitop bei HIV-1) trotz unterschiedlicher Evolution beider Retroviren. Aufgrund dieser Sequenzhomologie wurden jene Epitope in der FPPR und MPER von p15E, die von neutralisierenden Seren erkannt wurden, durch korrespondierende Sequenzen in gp41 ersetzt. Ziel dieser Arbeit war es, Immunisierungsstudien mit diesen Hybridproteinen durchzuführen und die induzierte Antikörperantwort zu charakterisieren. Hierfür wurden vier verschiedene Hybridantigene (N1, N2, N3, N4) konstruiert, in E. coli exprimiert und bis zu einer Reinheit von 95% aufgereinigt. Diese vier Antigene wurden für Immunisierungsstudien in Meerschweinchen, Ratten, Kaninchen und Ziegen verwendet, wobei die Tiere in einem 3 Wochenabstand immunisiert wurden. Nach jeder Immunisierung wurden die Antiseren der Versuchstiere auf die Induktion von HIV-1 spezifischen Antikörpern untersucht, sowie die Epitope jener Antiköperpopulationen bestimmt. Zusätzlich wurden die Seren auf virusinhibierende Wirkung von HIV-1 untersucht. Immunsierungen mit N1 oder N2 induzierten eine FPPR-fokussierte Immunantwort in Ratten und Meerschweinchen. MPER-spezifische Antikörper konnten nur in N2 immunisierten Ratten festgestellt werden, jedoch konnte keine HIV-1 neutralisierende Wirkung der Immunseren nach der Immunisierung mit den Hybridproteinen N1 oder N2 nachgewiesen werden. Immunisierungen von Meerschweinchen, Ratten und einer Ziege mit den Hybridantigenen N3 und N4 induzierten FPPR spezifische, sowie MPER bindende Antikörper, die das gleiche Epitop erkannten wie der breitneutralisierende Antikörper 2F5. Immunseren oder isolierte IgGs von Meerschweinen und Ratten zeigten keine Inhibition der HIV-1NL4-3 Infektion in den TZM-bl und C8166 Zell-basierten Neutralisationsassays nach Immunisierung mit N3. Nur für das Immunserum eines Meerschweinchens konnte eine schwache Neutralisation in dem PBMC Neutralisationsassay nachgewiesen werden, allerdings nicht für die isolierten IgGs aus diesem Immunserum. Trotzdem die Immunseren von Ratten und einer Ziege nach der Immunisierung mit N4 die selben Epitope erkannten wie nach den Immunisierungstudien mit N3 konnte eine virusspezifische, schwache Neutralisation von HIV-1NL4-3 durch ein Rattenserum und dem Ziegenserum nach der dritten Immunisierung mit N4 gezeigt werden. Dieser neutralisierende Effekt wurde allerdings nicht durch IgG oder MPER-spezifischen Antikörpern vermittelt, welche aus dem Serum isoliert wurden. Obwohl die Seren nach Immunisierung mit N4 nur einen schwachen neutralisierenden Effekt zeigten, stellt der Ansatz von Hybridproteinen einen innovativen Ansatz zur MPER gerichteten Vakzinentwicklung dar. Die genauere Untersuchung des Mechanismus zur Induktion von neutralisierenden Antikörpern durch Immunisierung mit dem Transmembranprotein p15E könnte dabei helfen, weitere Hybridproteine zu optimieren und damit eine stärker neutralisierende Immunantwort zu erlangen.

A vaccine against HIV-1 to keep the pandemic in bay is one of the major goals in vaccine development. Although the scientific field of vaccine development is largely supported with extensive fundings, attempts to design a vaccine to induce potent protection only remained successful in the macaque model, but not in human trials. In order to address this aim, different hybrid antigens were designed, comprising sequences of the HIV-1 and PERV transmembrane protein. P15E, the transmembrane protein of PERV was used as scaffold protein, since immunization with the ectodomain of different gammaretroviruses resulted in the induction of neutralizing antibodies in various animal species. These neutralizing sera recognized epitopes located in the MPER and in the FPPR of p15E. Alignments of gp41 and p15E showed a sequence homology within the MPER (F/YEGWFN in the case of gammaretroviruses and NWFNIT, the 4E10 epitope, in case of HIV-1) despite the evolutionary distance between PERV and HIV-1. Based on these findings, both epitope regions of p15E recognized by neutralizing sera were substituted by corresponding sequences derived from gp41 of HIV-1. One gp41 sequence contained the epitopes of 2F5 and 4E10 in the MPER and the other corresponded to the FPPR. Structural interaction of the MPER and the FPPR had been suggested as a reason for an increased binding of 2F5 to its epitope in the presence of peptides corresponding to the FPPR. In addition, a direct interaction of FPPR and MPER sequences during infection and a stabilization of the 6-helix-bundle formation by peptides corresponding to the MPER and FPPR have been demonstrated. These results allow speculations that an interaction of the FPPR with the MPER may be required to induce neutralizing 2F5-like and 4E10-like antibodies. On the basis of above mentioned considerations, four different recombinant hybrid proteins (N1, N2, N3, N4) were designed, produced by E. coli overexpression and purified up to a purity of 95%. These four antigens were used for immunization studies in guinea pigs, rats, goats and one rabbit in a three week immunization regimen. Humoral antibody responses were evaluated after each immunization with focus on anti-gp41 specific binding antibodies and antibody recognition sites within gp41. Immune sera were furthermore tested for inhibition of HIV-1 infection. Immunization studies with recombinant hybrid proteins N1 or N2 induced antibodies predominantly binding to the FPPR. Weak MPER-specific antibody responses were observed in rat sera after immunization with N2, these immune sera did not inhibit HIV-1NL4-3 infection. Immunization of guinea pigs, rats and one goat with N3 or N4 also induced antibodies binding to the FPPR of gp41, but also to the 2F5 epitope (ELDKWA) located in the MPER. Immune sera of guinea pigs and rats immunized with N3 did not show any inhibition of virus infection as tested in the TZM-bl neutralization assay. Although immune sera of rats and the goat immunized with N4 also recognized the same epitopes as after immunization studies with N3, immune sera of one rat and the goat showed a weak neutralizing effect after the second boost. However, IgG or CHR/MPER-specific antibodies isolated from these immune sera did not neutralize HIV-1NL4-3. Nonetheless, the strategy of hybrid proteins used as antigens was successful in focusing the antibody response towards the desired MPER epitope and immune sera after vaccination with N4