Regulation der Expression humaner endogener Retroviren in Melanomen

Abstract

Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt waren die Regulation der Expression der humanen endogenen Retroviren K(HML-2) in humanen Melanomen und die Auswirkungen des von HERV-K-kodierten Proteins Rec auf das Transkriptom der Zelle völlig unbekannt. Gleichwohl existierte eine Vielzahl an Untersuchungen über die Expression des endogenen Retrovirus in humanen Tumorproben. Aufgrund der klinischen Bedeutung von HERV-K und der möglichen Verwendung als Tumormarker sollte dieses genetische Element auf seine transkriptionelle Regulation in humanen Melanomzelllinien untersucht werden und weiterhin auf seinen möglichen Einfluss auf das Transkriptom der Zelle. Die in dieser Arbeit aufgezeigten Ergebnisse zur transkriptionellen Regulation der humanen endogenen Retrovirusfamilie K(HML-2) in humanen Melanomzelllinien verweisen auf einen zweistufigen Aktivierungsprozess der HERV-K-Expression. Hierbei bedarf es zum einen der Aktivierung von HERV-K spezifischen Transkriptionsfaktoren, welche über den U3-Enhancerbereich des LTRs die Aktivität des retroviralen Promotors erhöhen, und zum anderen bedarf es einer Aufhebung der CpG-Methylierung innerhalb der Promotorsequenz von HERV-K(HML-2).Wie in dieser Arbeit nachgewiesen werden konnte, vollziehen sich beide Aktivierungsschritte zeitlich und funktionell unabhängig voneinander. Der Nachweis genomweiter Demethylierung von HERV-K 5’LTRs in Melanomzellen lässt auf eine Störung der Aufrechterhaltung des Methylierungsgrades der zellulären genomischen DNA schließen und könnte aufgrund der damit in Verbindung gebrachten Erhöhung von chromosomaler Instabilität und einer möglichen Aktivierung von Onkogenen eine Ursache für die schlechte Prognose von Melanompatienten mit HERV-K Expression darstellen. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit der Einfluss des HERV-K Genproduktes Rec auf den zellulären Transkriptionsapparat untersucht. Hierfür wurde in der HERV-K nicht-exprimierenden Zelllinie HEK-293 eine Rec-Expression mittels eukaryotischer Expressionsplasmide durchgeführt und die daraus resultierende zelluläre Antwort mit Hilfe einer Affymetrix- RNA-Chip-Analyse ermittelt. Die Verifikation der Affymetrix-Chipdaten mittels RTreal- time PCR ergab eine differenzielle Regulation für fünf humane Transkriptionsfaktoren mit zellproliferativem Charakter (FGF18, ATF3, SOX30, ZNF91, ZNF256) und vier Spleißfaktoren (PSF, FOX2, Cyclin L1b, NFAR), welche an Prozessen des zellulären alternativen Spleißens beteiligt sind. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass eine Überexpression der Spleißfaktoren SF-9G8 und hnRNP-A1 einen Einfluss auf das HERV-K env-mRNA-Niveau ausübt. Die Aktivierung von proliferationsfördernden Transkriptionsfaktoren und alternativen Spleißfaktoren könnte die Ursache für pathogene Veränderungen in HERV-K Rec-exprimierenden Zellen darstellen.

Until now, transcriptional regulation of HERV-K(HML-2) proviruses in human melanomas was unclear. Especially the impact of the HERV-K accessory protein Rec on the gene expression profile of human cells was unknown. Nevertheless, there are several reports about expression of the human endogenous retrovirus K(HML-2) in human malignant diseases. The clinical importance of HERV-K and the possible function as a tumour marker for malignant melanomas made this genetic element interesting for further investigations. In this work, the genetic and epigenetic transcriptional regulation of HERV-K in human melanoma cell lines was investigated. Analysis of the 5’LTR promoter area showed that high levels of HERV-K expression were the result of increased levels of activated transcription factors and that transcription factor binding sides were located at the U3 region. Also the 5’LTR showed to be rich in CpG dinucleotides. Using various assays, a clear inverse correlation between methylation level and expression of HERV-K specific mRNA could be found. These results suggest a two-step activation mechanism leading to HERV-K transcription by transcription factor activation and 5’LTR demethylation. As it was shown in this work, both steps of transcription activation occur temporally und functionally independent. These results also implicate that the poor prognosis of melanoma patients with HERV-K expression could be due to a genome wide demethylation of retroviral elements which is associated with chromosomal instability and oncogene activation. Furthermore, the impact of the accessory protein Rec on the gene expression profile of human cells was investigated. Therefore, the Rec protein was expressed in HEK-293 cells, known to express HERV-K on a very basal level. Following, changes on the cellular transcriptome were analyzed by epression array analysis. Verification of differentially regulated genes was done by the use of quantitative RT-real-time PCR. Thereby, five transcription factors (FGF18, ATF3, SOX30, ZNF91, ZNF256), known to activate cell proliferation, showed to be up-regulated and four splicing factors (PSF, FOX2, Cyclin L1b, NFAR), known to regulate the process of alternative splicing, were changed in expression. Besides, an overexpression of the human splicing factors SF-9G8 and hnRNP-A1 in cell lines expressing HERV-K resulted in increased HERV-K env-mRNA levels. This activation of transcription factors and splicing factors after Rec expression could be a possible cause for pathogenic changes in HERV-K expressing cells.