Etablierung eines sensitiven quantitativen Nachweises proviraler HIV-1 – DNA zur Lokalisation der HIV-1 - Reservoire

Abstract

Auch im Jahr 2013 sind noch ca. 1,5 Millionen Menschen durch HIV/AIDS gestorben. Seit Jahrzehnten wird nun schon an der Bekämpfung der HI-Viren geforscht und gearbeitet. Der-zeit klinisch angewandte Antiretrovirale Therapien sind dazu imstande, die Produktion infektiö-ser Viruspartikel zu unterdrücken und damit die Verbreitung von HIV zu mindern sowie die Lebenserwartung des Patienten zu steigern. Die vollständige Eliminierung des Virus durch die Therapien ist jedoch aufgrund der Proviren, welche im Zellgenom integriert sind, nicht möglich. Die zelluläre HIV-Proviruslast ist neben der Viruslast im Blut und der CD4+-Zellzahl ein wichti-ger Parameter zur Beurteilung der AIDS-Progression. Dabei ist gerade bei Patienten unter antiretroviraler Therapie die HIV-Proviruslast ein verlässlicherer Parameter als die dann schwer zu bestimmende Viruslast im Blut. Die Lokalisation der sogenannten HIV-1 Reservoire ist hierbei eine wichtige Fragestellung. Es ist bekannt, dass innerhalb der CD4+-T-Zellen unterschiedliche Subpopulationen existieren. Von verschiedenen Arbeitsgruppen gibt es Hinweise auf bestimmte Subpopulationen, die vor-rangig als HIV-Reservoire dienen. Mithilfe dieser Bachelorarbeit sollte nun eine Methode zur Identifizierung dieser T-Zell-Subpopulationen, welche als HIV-Reservoire dienen, etabliert werden und die mögliche quantitative Messung von HIV-Proviren und Zellzahlen demonstriert werden. Dazu wurde zunächst eine bereits etablierte real-time PCR zur Quantifizierung der HIV-Proviren optimiert und eine den zu messenden Proben angepasste Standardreihe von HIV-1 Plasmiden in einer definierten Menge von humaner DNA erstellt. Weiterhin wurde mit ACH-2 Zellen, die eine bekannte Anzahl an HIV-Kopien pro Genom tragen, die Sensitivität der real-time PCR für die Messung von HIV-Kopien sowie für die Messung eines „single copy“ Gens, CCR5, zur Quantifizierung von humanen Zellgenomen bestätigt. Erstmalig wurden im Rahmen dieser Arbeit die HIV-1- und die CCR5-qPCR zu einer Duplex-PCR, bei der beide Reaktionen im selben Reaktionsgefäß ablaufen, vereint. Weiterhin wurde der Prozess der Zellanalyse mittels FACS (Durchflusszytometrie) erfolgreich optimiert, sodass es nun möglich ist, die verschiedenen T-Zell-Subpopulationen voneinander zu trennen und zu sortieren. Dazu wurden PBMC aus einer Blutprobe isoliert; mittels MACS gegen CD4 selektiert und im Anschluss mit ausgetesteten fluoreszenz-markierten Antikörpern eingefärbt. Da für die FACS-Analyse nur fixierte Zellen verwendet werden können, wurde eine Methode zur DNA-Isolation aus formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben für die An-wendung auf die FACS-Proben getestet. Dabei wurde festgestellt, dass mit dieser Methode, gegenüber der DNA-Isolation aus nicht-fixierten Zellen, kein DNA-Verlust auftritt, jedoch ein geringer Verlust bei der Quantifizierung der isolierten DNA-Proben in der real-time PCR zu verzeichnen ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass diese Methode nicht geeignet ist, DNA aus geringen Mengen von Zellen zu extrahieren. Da jedoch in Zukunft aus den sortierten Zell-Subpopulationen, die dann nur wenig Zellen ent-halten, DNA isoliert und in der real-time PCR getestet werden sollen, wurde versucht, die Effi-zienz der DNA Isolierung dahingehend zu optimieren. Nachdem gezeigt wurde, dass die CCR5-spezifische Primer/Sonden-Kombination nicht das murine CCR5 detektiert, wurden in zwei Versuchen humane PBMC mit zwei unterschiedlichen Zelllinien von Mäusen versetzt. In der aus diesen fixierten Proben isolierten DNA konnte jedoch nicht wie erwartet die eingesetz-te Menge an humanen Zellen mittels CCR5-spezifischer real-time PCR detektiert werden. Auf Basis dieser Arbeit sollte die Identifizierung der T-Zell-Subpopulationen, die die Reservoire für HIV-1 darstellen, sowie die Sortierung im geeigneten FACS-Gerät möglich sein, worauf weiterhin mittels der hier etablierten bzw. optimierten Methoden DNA gewonnen und in der real-time PCR die Anzahl der HIV-1 Proviren innerhalb einer Population bestimmt werden kann.