Etablierung einer Komplett-Genom-RT-PCR und Next-Generation-Sequencing für full-length Genome von HIV-1

Abstract

Die globale HIV-1 Epidemie wird durch die geografisch unterschiedliche Verbreitung von 9 HIV-1 Subtypen (A-D, F-H, J, K) und derzeit 72 zirkulierenden rekombinanten Formen (CRF) charakterisiert. Die genetische Diversität von HIV-1 kann Auswirkungen auf die Sicherheit der HIV-1 Diagnostik, den Krankheitsverlauf, die Impfstoffentwicklung und auf den Erfolg der antiretroviralen Therapie haben. In einer Kooperation zwischen dem „Central Public Health Laboratory“ des Omans und dem Robert Koch-Institut wurde bei omanischen Patienten mit Therapieversagen neben der genotypischen Resistenzanalyse auch der pol-Subtyp analysiert. Ca. 50 % der untersuchten Isolate konnten keinem definierten Subtypen oder einer bekannten zirkulierenden rekombinanten Form zugeordnet werden. Phylogenetische Analysen zeigten, dass 13 Isolate eine eigene monophyletische Gruppe (Clade) im Stammbaum bildeten, die sich in der Baumtopologie signifikant von allen bekannten Referenzviren abspaltet und als putative neue CRF eingestuft wurde. Um eine neue CRF von internationalen Experten definieren zu lassen, müssen von zwei Isolaten Komplett-Genomsequenzen vorliegen, eine dritte Sequenz kann partiell sein. Ziel dieser Arbeit war es, die full-length Sequenzen von drei epidemisch nicht verknüpften Isolaten der putativ neu identifizierten „URF-new clade“ zu vervollständigen, um in abschließenden phylogenetischen Sequenzanalysen dieser HIV-Variante eine Klassifi-zierung als neue CRF durchzuführen. Um ausreichend Virusmaterial zur Verfügung zu haben, wurden Virusanzuchten aus Plasma auf PBMC-Spenderzellen durchgeführt. Die HIV-Genome wurden mit einer etablierten „vier-Amplikon PCR“ amplifiziert. Zusätzlich wurden verschiedenen Protokolle einer „ein-Amplikon PCR“ ausgetestet, um zuverlässige Aussagen über inter-Subtyp-Rekombinationen treffen zu können. Die erhaltenen Sanger- Populationssequenzen wurden mit Konsensussequenzen anhand der neuen Next Generation Sequencing Technologie (NGS, Illumina) verglichen. Es konnte für zwei Plasmaviren die Komplett-Genomsequenz bzw. eine partielle Sequenz ermittelt werden. Mit einer dritten vorhandenen Komplett-Genomsequenz wurden phylogenetische und Rekombinations-Analysen durchgeführt, die das Vorliegen einer neuen CRF bestätigen. Der Vergleich der Sanger-Sequenzen mit über NGS ermittelten Sequenzdaten zeigte eine Übereinstimmung von mindestens 98,4 %. Mit NGS konnten mehr Ambiguitäten als mit der Sanger-Methode bestimmt werden. Es sind jedoch noch weitere NGS-Validierungs-schritte nötig, um einen Grenzwert für die Unterscheidung von Hintergrund zu Ambiguitäten zu definieren, mit dem dann die NGS-Sequenzen der HIV-Quasispezies ausgewertet werden können. Im Oman sind weitere Untersuchungen zur Ermittlung der Prävalenz und epidemischen Relevanz der neuen Variante in Planung.