Nähere Charakterisierung von phylogenetisch nicht klassifizierbaren rekombinanten Formen von HIV-1

Abstract

Das humane Immundefizienzvirus (HIV), ursprünglich entstanden durch eine zoonotische Transmission, ist der Erreger des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS). Hierbei verursacht HIV-1 Gruppe M eine weltweite Epidemie, wobei unter den neun Subtypen und bis dato 88 bekannten rekombinanten Formen (CRFs) global der Subtyp C am verbreitetsten ist. Durch Mutation und Rekombination unterliegen die Viren jedoch einer stetigen Diversifizierung, was zur Entstehung immer neuer, vornehmlich singulärer rekombinanter Formen (URFs) führt. Da diese genetische Diversität Konsequenzen für die antiretrovirale Therapie, die Sicherheit der Diagnostik, die Impfstoffentwicklung und möglicherweise auch für die Pathogenität hat, ist die Beobachtung der epidemischen Verbreitung verschiedener HIV-1 Subtypen und rekombinanter Formen von großer Public Health Bedeutung. Vor Initiierung einer antiretroviralen Therapie oder bei Therapieversagen wird zur Identifikation von resistenz-assoziierten Mutationen eine genotypische Resistenztestung anhand der Sequenz der viralen Protease (pr) und Reversen Transkriptase (rt), teilweise auch der Integrase (int), vorgenommen. Die erzeugten Virussequenzen können zudem für die Bestimmung des HIV-Subtyps herangezogen werden. Jedoch ist anhand der sehr konservierten prrt-Sequenz eine eindeutige Klassifizierung nicht immer möglich, da markante Rekombinationspunkte häufig außerhalb dieses Bereichs liegen. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit 45 Proben von HIV-1 positiven Patienten näher untersucht durch die zusätzliche Betrachtung der viralen int- und env (Hüllprotein)-Sequenzen. Insgesamt konnte für 24 von 25 untersuchten Proben eine valide int-Sequenz und für 30 von 45 untersuchten Proben eine valide env-Sequenz generiert werden. Für die Subtypisierung anhand der Einzelsequenzen sowie der vorliegenden Gesamtsequenzinformation wurden verschiedene Webtools und eine eigene Maximum-Likelihood-Phylogenie eingesetzt und die Ergebnisse auf Konkordanz verglichen. Aufgrund der unterschiedlichen Algorithmen, auf denen die webbasierten Subtypisierungstools basieren, zeigten sich vor allem in dem hochvariablen env-Bereich mit 39,9 % deutliche Unterschiede bei der Klassifizierung, wohingegen die Übereinstimmung in der recht konservierten prrt-Region mit 76,7 % relativ hoch war. Von insgesamt 25 der 45 Proben lag eine Sequenz in allen drei untersuchten Genombereichen vor. Anhand dieser umfassenden Sequenzinformation konnten mit dem REGA HIV-1 Subtyping Tool dennoch nur drei Proben eindeutig klassifiziert werden, wohingegen mittels der eigenen Phylogenie 18 Proben eindeutig zugeordnet werden konnten. Bei den verbleibenden sieben Proben könnte es sich um URFs handeln. Insgesamt lässt sich schlussfolgern, dass für eine korrekte Subtypisierung eine eigene phylogenetische Analyse anhand mehrerer Genomregionen erfolgen muss und das für die nähere Charakterisierung von URFs und die Bewertung ihrer epidemischen Relevanz eine Gesamtgenom-Sequenzierung notwendig ist.

The human immune deficiency virus (HIV) causes the acquired immune deficiency syndrome (AIDS) and was originally developed through a zoonotic transmission. The epidemic relevant type is HIV-1 group M comprising nine subtypes and up to date 88 circulating recombinant forms (CRFs). Globally, subtype C is most common. HIV is subjected to continuous diversification and recombination, steadily giving rise of unique recombinant forms (URFs) of which some become epidemic. The molecular surveillance of currently circulating HIV variants is an important public health aspect as the genetic diversity of HIV has consequences on antiretroviral therapy, diagnostic, vaccine development and potentially pathogenicity. HIV sequences of viral protease (pr) and reverse transcriptase (rt), in some cases also integrase (int), determined by genotypic resistance testing can be used to identify the HIV subtype. However, the prrt-region is quite conserved and breakpoints of recombination are often located outside this region. The aim of this bachelor thesis was to further characterize the subtype of 45 viruses using int- and env (envelope)-sequences in addition to prrt-sequences. To this end, 25 and 45 plasma samples of HIV-1 positive patients were analyzed for viral int and env, respectively. In total, 24/25 valid int-sequences and 30/45 valid env-sequences could be determined. Several webtools using different algorithms for subtyping as well as an own maximum-likelihood-phylogeny were applied to classify the viruses based on their respective sequence information. When comparing the outcomes, the biggest difference between the webtool interpretations was observed in the highly variable env-region, whereas the results for the conserved prrt-region were quite concordant. For 25 samples, the full sequence information on prrt, int, and env was available. Only three of the 25 samples could be clearly classified using the REGA HIV-1 Subtyping Tool, whereas 18 samples could be subtyped by the maximum-likelihood-phylogeny. The remaining seven samples are supposed to be URFs. In conclusion, analysis of several genomic regions by maximum-likelihood phylogeny is necessary for correct determination of HIV-1 subtypes. Full length-sequencing is needed for further characterization of URFs.