Optimierung von PCR-Methoden zur sensitiven Quantifizierung und Charakterisierung des proviralen Reservoirs in HIV-1 infizierten Patienten

Abstract

Die hochaktive antiretrovirale Therapie (HAART) ermöglicht die Suppression der Plasma-virämie eines HIV-1 Patienten bis unter die Nachweisgrenze. Eine vollständige Eradikation des Virus ist jedoch mit antiretroviralen Medikamenten alleine nicht möglich. Die größte Barriere stellen die latent infizierten, ruhenden CD4+ T-Gedächtniszellen dar, welche ein äußerst stabiles Reservoir bilden. Durch die Erkenntnis, dass sich die Gedächtniszellen in verschiedene Subpopulationen mit unterschiedlichem Differenzierungsgrad, Phänotyp und Funktionsumfang unterscheiden lassen, ist das Interesse an einer genauen Charakterisie-rung dieses viralen Reservoirs groß. Das Ziel dieser Arbeit war die Optimierung und Etablierung geeigneter PCR-Methoden zur Charakterisierung des proviralen HIV-1 Reservoirs, sowie eine darauffolgenden Analyse von Patientenmaterial. Für die genutzte direkte Lyse Methode wurde das Lysevolumen im Hinblick auf die weitere Verarbeitung der Proben angepasst und eine Angleichung der Zell-zahl für jede Probe etabliert. Die HIV-1/CCR5 qPCR zur Quantifizierung der proviralen HIV-1 DNA zeigte für Plasmid- und genomische DNA eine Detektionsgrenze von einer einzigen Kopie HIV-1. Zur Erhöhung der Spezifität und Validierung der mittels qPCR gewonnen Da-ten, wurde eine HIV-1 spezifische nested-PCR etabliert, die ebenfalls ein Detektionslimit von einer einzelnen HIV-1 Kopie aufzeigte. Anhand in vitro infizierter PBMCs konnte ein Probelauf des Workflows zur Charakterisie-rung des proviralen Reservoirs durchgeführt werden. Die Zellen wurden mittels FACS in die Subpopulationen TN, TSCM, TCM, TTM und TEM sortiert und die HIV-1 DNA mittels qPCR quantifiziert. Im Rahmen der weiteren Evaluierung wurden DNA-Proben von zwei HIV-1 Patienten zur Verfügung gestellt, deren proviraler Status mittels qPCR und nested-PCR getestet wurde. Die hier erzielten Ergebnisse ergänzen stimmig die bereits bekannten Daten zur Viruslast im Plasma der Patienten. Zudem wurden sechs Vollblutproben von langzeitinfizierten HIV-1 Patienten aufbereitet, mittels FACS in die verschiedenen Subpopulationen sortiert und eine Quantifizierung der proviralen HIV-1 DNA mit der qPCR durchgeführt. Für zwei Patienten konnte in verschiedenen Subpopulationen virale DNA nachgewiesen werden, während die restlichen Patienten sowohl in der qPCR, als auch in der nested-PCR negativ getestet wurden. Für die ddPCR konnten erste Schritte zur Übertragung des Assays zur gleichzeitigen Quantifizierung von HIV-1 und CCR5 DNA durchgeführt werden. Die in die-ser Arbeit optimierten und etablierten Methoden sind geeignet zur hochsensitven Quantifi-zierung von HIV-1 Proviren in Patientenmaterial und können zukünftig zur Charakterisie-rung des proviralen Reservoirs eingesetzt werden.

The development of highly active antiretroviral therapy (HAART) for the treatment of HIV-1 infection was a major victory in the fight against HIV/AIDS, as it transformed a fatal dis-ease into a controllable chronic infection. Despite this remarkable success, HAART alone cannot cure HIV infection and infected patients must continue taking antiviral drugs for the rest of their lives. The major barrier to eradicating HIV from the body is the persistence of latent HIV in resting CD4+ T memory cells. This small pool of latently infected cells remains extraordinarily stable despite successful long-term treatment. CD4+ T memory cells can be divided into different subpopulations with various stages of differentiation, phenotypes and functions. The particular properties of the subpopulations could play a significant role in maintaining the viral persistence and a precise characterization of the reservoir is there-fore of major interest. The aim of this thesis was the optimization and establishment of PCR-methods for the characterization of the proviral HIV-1 reservoir, as well as the analysis of patient samples. The direct lysis method used for the extraction of genetic material from fixed cells was modified to improve subsequent steps in the analysis. The HIV-1/CCR5 qPCR assay to quantify proviral HIV-1 DNA demonstrated extraordinary sensitivity, being able to detect a single copy of the viral genome. An HIV-1 specific nested-PCR was also established to fur-ther increase the specificity of the assay and was also shown to be capable of detecting a single copy of HIV-1 DNA. This facilitates the reliable detection of HIV-1 in patient samples and can be utilized to validate qPCR results. As a 'proof of principle' an in vitro infection of PBMCs with HIV-1Bal was performed and the cells sorted by FACS into the subpopulations TN, TSCM, TCM, TTM and TEM before quantifying the proviral HIV-1 DNA using the HIV-1/CCR5 qPCR. Samples from different HIV-infected patients were examined. First, DNA samples from two patients with known levels of viremia involved in the RKI HIV-1 seroconverter study were successfully tested with the HIV-1/CCR5 qPCR and the nested-PCR. A further six blood samples from long-term infected HIV-1 patients under therapy were processed and sorted by FACS into the different subpopulations and their proviral DNA quantified with the HIV-1/CCR5 qPCR. Two of the patients tested positive for HIV-1, whereas the oth-ers remained negative with both the qPCR and the nested-PCR. The introduction of ddPCR at the RKI offered the opportunity to test this assay and to establish it as an alternative quantification method to be incorporated into the workflow.