Herstellung und Evaluation von Transduktionskonstrukten für die Etablierung eines ADCC-Assays für SIV/SFV

Abstract

In dieser Arbeit sollte eine Expressionssystem für die Oberflächenproteine von SIV und SFV etabliert werden und die Funktionalität dieser Proteine sichergestellt werden. Diese Arbeiten dienen als Vorbereitungen für einen ADCC-Assay für SIV und SFV, da die eingesetzten Zielzellen so verändert werden, dass sie die Env-Proteine auf ihrer Oberfläche exprimieren. Die Sequenzen der Hüllproteine sollten in den pMXs-Puro-Vektor des verwendeten retroviralen Expressionssystems kloniert werden, die Signalsequenz und die Transmembrandomäne der Konstrukte wurde durch die des pDisplay-Vektor ersetzt. Die Klonierung der Oberflächenproteine gelang nur für die beiden wildtypischen env-Varianten SIVmac293 und SFVmac289 und konnte durch Sequenzierung abgesichert werden. Die Expression der Hüllproteine auf den Zellen wurde durch verschiedene Versuche überprüft. Es gelang im cLSM (konvokale Laserscanningmikroskopie) die Produktion des SIV Env nach Transfektion von 293T-Zellen nachzuweisen. Um abzusichern, dass die Expression auf der Oberfläche stattfindet, wurde eine FACS-Analyse (Durchflusszytometrie) durchgeführt, in der eine Population von bis zu 25% Env-positiven Zellen nachgewiesen werden konnte. Es stellte sich in einer weiteren FACS-Analyse heraus, dass lediglich 0,35% aller CEM-NKR-Zellen, bei denen es sich um NK-resistente Zellen handelt die innerhalb des ADCC-Assays als Zielzellen eingesetzt werden sollten, nach erfolgter Transduktion Env exprimieren. Der von den Verpackungszellen produzierte virale Überstand wurde durch einen reverse Transkriptase Assay, mit dem die reverse Transkriptase im Zellüberstand quantifiziert werden kann, untersucht. Es zeigte sich, dass retroviralen Partikel nur in geringem Maße gebildet werden. Um die Transduktionseffizienz zu erhöhen wurden Versuche mit Spinoculation durchgeführt. Dabei werden Zellen und Viren zusammen zentrifugiert, was bei verschiedenen Zelllinien zu einer erhöhten Transduktionsrate führt. Es zeigte sich, dass ein hochkonzentrierter Virus für diese Infektion eingesetzt werden muss. Die Herstellung der Transduktionskonstrukte bedarf weiteren Optimierungen um einen ADCC-Assay durchführen zu können. Als alternativer Ansatz neben der Generierung einer Zellinie, die Env stabil exprimiert, wurde Versuche zur Spinoculation mit SIVmac293 durchgeführt.