Etablierung und Validierung einer HIV-1-spezifischen int RT-PCR zur genotypischen Resistenzbestimmung von HIV gegenüber Integrase Inhibitoren

Abstract

Obwohl die Resistenzentwicklung gegen antiretrovirale Medikamente durch den Einsatz moderner Kombinationstherapien reduziert werden konnte, kann es unter suboptimaler Medikation zur Virusreplikation und Selektion von resistenten Virusvarianten kommen. Bei der Therapie von HIV kommen Integrase-Inhibitoren aufgrund ihrer guten Verträglichkeit sowie als Alternative zu PI, NRTI und NNRTI immer häufiger zum Einsatz. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung und Validierung einer sensitiven subtypgenerischen RT-PCR zur Amplifizierung und Sequenzierung des Integrase-ORF. Hierzu wurde die RNA mithilfe des QIAamp Viral RNA Mini Extraction Kit extrahiert. Die RT-PCR Primersequenzen sowie das PCR-Protokoll stammten aus der Arbeitsgruppe von Dr. Rolf Kaiser (Virologisches Institut der Universität Köln). Die RT-PCR wurde mit dem QIAGEN OneStep RT-PCR Kitsystem als Einschrittreaktion konzipiert. Das PCR-Fragment besaß eine Größe von 916 bp und wurde nach Sanger sequenziert. Zur Bestimmung der Sensitivität wurde das HIV-1 Isolat NL4.3 des Subtyps B als Konzentrationsstandard genutzt. Zur Überprüfung der subtypgenerischen Amplifikation wurde ein Subtypenpanel aus 16 Isolaten der Subtypen A, B, C, D, F, G, H, CRF01_AE und CRF02_AG zusammengestellt und anhand von seriellen Verdünnungsreihen die Nachweisgrenze ermittelt. Die Viruslast aller Isolate wurde mit einer gruppengenerischen TaqMan Real-time RT-PCR quantifiziert. Ein Patientenpanel sowie die Teilnahme an einem Ringversuch dienten der Validierung des Systems. Die Sensitivität für Subtyp B NL4.3 wurde mit 457 geq/ml (+/- 260 geq/ml) als ausreichend für genotypische Resistenzanalyse erachtet. Für die Subtypen A, B, D, G, H und die rekombinanten Viren CRF01_AE und CRF02_AG des Panels wurde eine als ausreichend bewertete Nachweisgrenze zwischen 550 und 10.000 geq/ml erreicht. Es zeigte sich, dass die Subtypen C und F mit einer 100 (F) bis 1.000 (C) fach geringeren Sensitivität als die anderen Referenzviren nachgewiesen werden konnten. Für phylogenetische Unterscheidungen der bekannten Subtypen, reichte das sequenzierte 840 bp lange Fragment aus. Die Validierung anhand des Patientenpanels enthüllte eine Reihe von minoritären resistenz-assoziierten Mutationen, welche eher als Polymorphismen anzusehen sind. Durch die Teilnahme an einem internationalen Ringversuch, konnte das System einer externen Qualitätskontrolle unterzogen werden.