Analyse und Quantifizierung der frühen Eintrittsphase der HERV-K Viren in die Zelle

Abstract

Der frühe Eintrittsprozess der HERV-K Viren weißt noch zahlreiche Fragen auf. Endgültige Untersuchungen in Bezug auf den Entry-Prozess konnten noch nicht getroffen werden. Daher sind Fragen über die Kinetik des intrazellulären Transports oder die Bildung replikationskompetenter Viren nicht endgültig geklärt.[1][2] Durch die Rekonstruktion einer möglichen Wildtypsequenz durch Rückmutationen und einer Codonoptimierung wurde die Expression viraler Proteine verstärkt.[3] Basierend auf der viralen Wildtypsequenz soll, im Rahmen dieser Arbeit, der Entry-Prozess mit Hilfe fluoreszenzmarkierter Proteine verfolgt werden. Es handelt sich dabei um ein mit mCherry markiertes oricoGag. Die Auswertung erfolgt dabei durch das FACS und durch lichtmikroskopische Untersuchungen. Fluoreszenzmarkierte Proteine sind für Untersuchungen von viralen Proteinen und intrazellulären Strukturen gut geeignet. Die Herstellung von fluoreszenzmarkierten reifen und unreifen virus-like particles sollte die Unterschiede während des Eindringens in die Wirtszelle aufzeigen. Reife VLPs werden durch die Protease gebildet, zerfallen, wenn sie in das Cytoplasma gelangen, sehr schnell. Der Vermutung, ob unreife VLPs länger im Cytoplasma bestehen können, sollte nachgegangen werden. Zusätzlich sollten Untersuchen über die Eintrittsphase durch das infektiöse Glycoprotein VSV-G und der nicht infektiösen Mutante VSV-Gmut erfolgen. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass fluoreszenzmarkierte VLPs erzeugt werden können. Die Ausbeute an fluoreszenzmarkierte VLPs, in denen keine Protease enthalten ist, konnte in nicht ausreichenden Mengen produziert werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Mutante des VSV-G Hüllprotein, welches zur Pseudotypisierung benutzt wurde, dieses Glycoprotein funktionslos macht. Mittels ELISA und PERT konnten die VLPPräparationen mit einander verglichen werden. Dadurch war es möglich die definierte Menge an VLPs mit einem funktionellen Env bzw. der Kontrolle mit nicht-infektiösem Env, für Infektionsversuche einzusetzen. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Fluoreszenzintensität mit VSV-G über einen bestimmten Zeitpunkt verstärkt wird, während es bei VSV-Gmut zu keinen Änderungen gekommen ist.